PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường.

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC

Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN

Lớp : 49 CNSH

Khoá : 49

Nha Trang, tháng 7 năm 2011

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC

Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN

Lớp : 49 CNSH

Khoá : 49

Nha Trang, tháng 7 năm 2011

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học

và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường.

Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Lê Đình Đức, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp 49SH, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.

Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua.

Nha Trang, tháng 6 năm 2011

Sinh viên

Lê Thanh Huân

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio của 5 chủng Lactobacillus trên

môi trường MRS, ở nhiệt độ 37 o C Error: Reference source not found

Bảng 3.2: Kết quả thử các đặc tính của hai chủng L1.2 và L1.3 52

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 : Cá chim vây vàng Error: Reference source not found

Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1,

C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định

bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37 o C Error: Reference source not found

Hình 3.2: Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h

nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30 o C Reference source not found

Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường

MRS nuôi ở 34 0 C Error: Reference source not found

Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X

Reference source not found

Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram của chủng L1.2 Error: Reference source not

found

Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 trên sau 24h trên môi trường

MRS nuôi ở 34 0 C Error: Reference source not found

Hình 3.7: Hình thái tế bào của chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X

Reference source not found

Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 Error: Reference source not found

Hình 3.9: Khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3 Error: Reference source

not found

Hình 3.10: Khả năng lên men các loại đường của chủng L1.2 và L1.3

Reference source not found

Hình 3.11: Mối tương quan giữa thời gian và OD 600 nm của chủng L1.2

Reference source not found

Hình 3.12: Mối tương quan giữa thời gian và OD 600 của chủng L1.3 .

Reference source not found

Hình 3.13 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát

triển của chủng L1.2 và L1.3 Error: Reference source not found

Hình 3.14: Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào sống

của hai chủng L1.2 và L1.3 ở OD 600 nm. Error: Reference source not found

Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng

L1.2 và L1.3 Error: Reference source not found

Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng

L1.2 và L1.3 Error: Reference source not found

KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nghành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triểnnhanh chóng Theo công bố của FAO năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản củaViệt Nam là 1,67 triệu tấn, xếp vị trí thứ 6 Châu Á Hiện nay đối tượng nuôi trồng chủ

yếu là các loài thủy hải sản nước mặn như: cá mú (Epinephelus spp), cá giò (Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcariper), cá cam (Seriola spp), cá hồng (Lutijanus erythropterus), cá chim (Trachinotus blochii), ốc hương (Babylonia areolata), vẹm xanh (Perna viridis), tôm sú (Penaeus monodon), trong đó đối tượng nuôi mới là

cá chim vây vàng đang được chú ý phát triển nuôi bởi vì thịt cá thơm ngon hấp dẫn, hàmlượng dinh dưỡng cao, rất được ưa chuộng

Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) là loài phân bố tương đốirộng ở vùng biển nhiệt đới, Tây Thái Bình Dương, Nhật Bản, Đài Loan, Indonesia, miềnNam Trung Quốc Nước ta cá phân bố chủ yếu ở vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ

Cá có kích cỡ thương mại 0,8 -1 kg/con, giá trị kinh tế cao với giá bán 100.000 VNĐ/kg,thị trường xuất khẩu: Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc, Hồng Kông, Mỹ, Singapore.Đây là một đối tượng nuôi mới ở Việt Nam, chưa được nghiên cứu nhiều nên người nuôivẫn gặp khó khăn do tỷ lệ cá chết cao, sức chống chọi trước các điều kiện bất lợi củamôi trường và các vi khuẩn gây bệnh còn thấp đặc biệt là các bệnh do Vibrio gây ra

Để khắc phục tình trạng này, người nuôi đã dùng các loại hóa chất khử trùng, cácchất kháng sinh phòng bệnh Tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp này không cao,ngược lại còn gây ảnh hưởng đến môi trường, nguy hiểm hơn nếu lạm dụng chất khángsinh sẽ gây ra tồn dư kháng sinh và hiện tượng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gâybệnh trên thủy sản Vì vậy, việc tìm ra một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này

là rất quan trọng

Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang nhữngđặc tính: đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, sinh các enzyme tiêu hóa, phân hủy các chấthữu cơ thừa …đã được áp dụng Các chế phẩm sinh học không những tăng khả năngsinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho vật nuôi mà còn hạn chế được tối đa khả năng sử

dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh thủy sản Nhiều nhóm vi sinh vật mang các

đặc tính probioic đã được áp dụng, trong đó có nhóm vi khuẩn Lactobacillus.

Với lí do như vậy nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển

chọn và đánh giá tiềm năng probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập trên

Các nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Phân lập các chủng Lactobacillus và Vibrio trong ruột cá chim vây vàng.

- Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính khảng Vibrio.

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Lactobacillus.

- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hơp cho các chủng Lactobacillus.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về probiotic

1.1.1 Giới thiệu vê Probiotics

Theo Tổ chức nông nghiệp và lương thực của Liên hợp quốc (FAO) “Probiotic là

những vi sinh vật sống, nếu được bổ sung với liều lượng hợp lý sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ”.

Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhưngtác dụng của nó đã được nhận thấy từ lâu Elie Metnhicoff là người đầu tiên đặt nềnmóng cho việc sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908) Năm 1908, ông đề nghị sử dụng vi

khuẩn lactic (Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài tuổi thọ con người

Ngày nay chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả để phòng bệnh chongười và vật nuôi Chế phẩm probiotic đang được sử dụng như một loại thuốc để phòng

và điều trị bệnh cho người và vật nuôi Các nghiên cứu cho thấy chế phẩm này mang lạinhiều lợi ích cho đường ruột như: cân bằng hệ vi sinh vật khu trú trong đường ruột, kíchthích tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch và phòng ngừa nhiễm trùng cho cơ thể Ngoài ra,chế phẩm probiotic sử dụng trong y học còn có khả năng giảm viêm, giảm cholesteron,tăng quá trình hấp thu khoáng, ngăn ngừa sự phát triển vi khuẩn gây bệnh viêm ruột,điều hoà trường hợp không dung nạp lactose và đề phòng được ung thư kết tràng… Một

số chủng vi sinh vật đã được sử dụng trong chế phẩm probiotic cho người như:

Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus johnsonii, Bacillus subtilis…

Nhiều chủng vi khuẩn cũng được sử dụng để sản xuất ra các chế phẩm ứng dụng

rất hiệu quả nhằm kiểm soát côn trùng gây hại cho cây trồng như vi khuẩn Bacillus

thuringiensis, nấm Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae, virus NPV.v.v Ngoài

ra các chế phẩm vi sinh còn được sử dụng để làm phân bón vi sinh nhằm phân giải cácchất hữu cơ làm giàu cho đất, phân giải lân khó tiêu thành lân dễ tiêu để cây trồng hấp

thu được Các chế phẩm vi sinh sử dụng trong các hệ thống xử lý rác thải và nước thải,làm sạch dầu mỏ trong các vụ tràn dầu

Mặc dù vậy, việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản (tôm, cua, cá,nhuyễn thể…) vẫn còn khá mới mẻ, mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây Đối vớimỗi loài thủy sản khác nhau cần có chế phẩm probiotic với những chủng vi sinh vậtthích hợp riêng Phương thức sử dụng chủ yếu là bổ sung trực tiếp vào thức ăn hoặcthêm vào môi trường nước nuôi Nhiều nhà nghiên cứu trong lĩnh vực này đều nhận thấychế phẩm Probiotic đã tạo ra những thay đổi đáng kể về khu hệ vi sinh trong đường ruộttheo hướng cân bằng có lợi trong đó các vi khuẩn có ích tăng đáng kể, số lượng các vi

sinh vật có khả năng gây bệnh như E.coli, Samomella, Listeria…giảm mạnh Những phát

hiện mới về khả năng tăng cường miễn dịch, điều chỉnh những sai lệch bất lợi ở hệ visinh vật đường ruột do bênh nhiễm khuẩn, virus, dị ứng thức ăn đang mở ra triển vọng

áp dụng chế phẩm này trong nuôi trồng thủy sản, cân bằng sinh thái và bảo vệ môitrường

* Thành phần chế phẩm probiotic

Vi sinh vật trong chế phẩm Probiotic thường gồm 4 nhóm sau:

- Nhóm vi khuẩn lactic: Thường chọn các chủng vi khuẩn lactic điển hình

thuộc giống Lactobacillus (Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus casei …) Trong hoạt động sống vi khuẩn lactic chuyển đường thành

axit lactic, ngoài ra nó có thể sinh ra Baterioxin – một loại hợp chất có hoạt tínhkháng khuẩn và có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng Loại chất kháng sinh này khônggây ra tính kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây bệnh Axit lactic và Bacterioxin cókhả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, giải độc cho đường ruột

- Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: Chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính αamylase và protease Các chủng này không gây độc, gây bệnh cho người và vật nuôi.Nhóm vi khuẩn này có tác dụng phân giải các hợp chất hữu cơ bị ô nhiễm trong môi

trường Thường chọn các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus (Bacillus subtilis,

Bacillus megaterium, Bacillus lichenifomis,… ) Ngoài khả năng sinh α amylase và

protease chúng còn sinh ra Bacterioxin Các vi khuẩn này chủ yếu tham gia vào quátrình làm sạch môi trường và tham gia vào quá trình đấu tranh sinh học, ức chế vikhuẩn gây bệnh, hạn chế dịch bệnh cho vật nuôi.

- Nhóm vi khuẩn quang tự dưỡng ( Photoautotrop): Gồm các vi khuẩn tía và

vi khuẩn không tía có khả năng đồng hóa H2S và CO2 để xây dựng tế bào và khôngsinh ra O2 Trong khi phân hủy H2S hoặc muối sulfua kim loại gây ra, làm giảm tínhđộc cho môi trường Khi cho thêm vi khuẩn quang tự dưỡng vào thức ăn hoặc môitrường nước nuôi có thể loại bỏ nhanh chóng NH3, H2S, axit hữu cơ, những chất cóhại, cân bằng pH, cải thiện chất lượng nước

- Nhóm nấm men: Gồm một số loài thuộc giống Sacaromyces, sử dụng nấm

men sẽ có tác dụng tận dụng lượng đường được tạo thành trong môi trường nước đểlên men rượu nhẹ, hạn chế dinh dưỡng của các loại vi sinh vật gây bệnh khác, cảithiện mùi và màu của nước

1.1.2 Cơ chế tác động của probiotic

1.1.2.1 Sản sinh ra các chất ức chế

Các vi khuẩn probiotic sinh các chất ức chế: bacteriocin, siderophores, lysozym,protease, H2O2, các axit hữu cơ, amoni, diaxetyl…các chất này được sinh ra bên trongđường ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vikhuẩn gây hại khác (Saurabh S, Choudhary AK và Sushma GS, 2005).Ví dụ:

Lactobacillus sp sản sinh ra bacteriocin là chất ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn gây

bệnh Alteromonas sp dòng B-10-31 sản sinh monostatin làm ức chế hoạt tính protease của Aermonas hydrophyla và Vibrio anguillarum.

1.1.2.2 Cạnh tranh cơ chất, năng lượng với những vi khuẩn khác

Cạnh tranh dinh dưỡng của các vi sinh vật probiotic có vai trò quan trọng trongviệc đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật bên trong đường ruột và bên ngoài môitrường nuôi Probiotic có khả năng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng đối với các vi khuẩnlây bệnh và sẽ hạn chế được sự phát triển, lây lan của các chủng vi sinh vật đó Vi khuẩn

có hại bị loại bỏ có nghĩa là loại bỏ được đối thủ cạnh tranh chất dinh dưỡng và nănglượng dùng cho vi khuẩn probiotic và cho vật chủ.

Ví dụ: sự hấp thụ các monosaccarit của các vi sinh vật probiotic có thể làm giảm

sự phát triển của Clostridium difficile gây ra bệnh tiêu chảy trên vật nuôi bởi vì sự phát triển của Clostridium difficile phụ thuộc vào các monosaccarit (Kenneth, H.Wilson và

Fulvio Periniz, 1998) Ngoài ra các vi khuẩn sinh siderophore được sử dụng làmprobiotic để cạnh tranh Fe với các vi khuẩn gây hại Vì siderophore là chất có khối lượngphân tử thấp, nó có khả năng gắn với các ion Fe Siderophore có thể hoà tan Fe kết tủathành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật, do đó nó là công cụ thu lượm Fe trong môitrường

1.1.2.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh

Cạnh tranh vị trí bám dính trên đường ruột là một tiêu chí quan trọng để dánh giáhiệu quả của vi sinh vật probiotic (Ringo E và Gatesoupe FJ, 1998) Vi khuẩn probioticcạnh tranh vị trí bám dính trên thành ruột hay trên các biểu mô khác có vai trò ngăn cản

sự khu trú và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Người ta đã chứng minh khả năng

bám dính và phát triển trên bề mặt ruột của Lactobacillus GG và Lactobacillus

plantarum 299V để ngăn cản sự phát triển và lây lan của vi khuẩn Escherichia coli 0157H7 gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật nuôi (Mack DR, Michail S, Wei S,

Macdougal L, Hollingsworth MA, 1999) Ngoài ra một số vi khuẩn thuộc giốngLactobacillus cũng được biết có thể khóa chặt các thụ thể bề mặt trong đường ruột đểhạn chế được sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh khác (Bernet MF, Brassart D,Neeser JR, Servin AL, 1994 )

1.1.2.4 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Chế phẩm probiotic có tác động tích cực lên hệ thống miễn dịch của cơ thể.Nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn trong chế phẩm probiotic có khả năng tăngcường quá trình sản xuất các kháng thể và gi i phóng cytokin gây ra đáp ngả ứ

mi n d ch cho c th ễ ị ơ ể (Jon A Vanderhoof, M.D., Series Editor, 2005) Probiotic

còn tác động lên các tế bào tua, từ đó cảm ứng tế bào limpho T để dung nạp/điều hòa vàkích thích các đáp ứng miễn dịch.Ngoài ra, kháng nguyên của vi khuẩn probiotic kíchthích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh, các chhất ứcchế của probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả kháng thể của vật chủ

Người ta thấy rằng bổ sung vi khuẩn lactic làm tăng khả năng chống lại bệnhtruyền nhiễm đường ruột Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy probiotic có ảnh hưởngquan trọng đối với các đáp ứng miễn dịch thích ứng ở những bệnh như dị ứng sữa bò ởtrẻ em, viêm khớp tự miễn ở người lớn

1.1.2.5 Cải thiện chất lượng nước

Chế phẩm probiotic giúp giảm nồng độ các chất hữu cơ trong nước, giảm hàmlượng BOD, giảm độc do amoni, nitrat và khí hydrosunfua, khống chế được vi khuẩngây bệnh Các vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có thể cải thiện chất lượng nước bởichúng có thể sử dụng các chất hữu cơ dư thừa hoặc các chất khí như H2S để làm chất

dinh dưỡng thông qua các enzyme ngoại bào (Prieur và cộng sự,1990).

- Trong trồng trọt: Chế phẩm probiotic có tác dụng với nhiều loại cây trồng (baogồm cây lương thực, cây ăn quả, cây hoa màu…) và ở mọi giai đoạn sinh trưởng phát

triển khác nhau (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2004) Những nghiên cứu về tác dụng của

probiotic với cây trồng cho thấy chúng có thể:

+ kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả và quá trình chín của quả,

+ cải thiện hệ vi sinh vật đất, ngăn chặn các mầm bệnh,

+ tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng và kéo dài được thờigian bảo quản, tăng chất lượng các sản phẩm tươi sống, làm cho hoa trái tươilâu

Dùng chế phẩm probiotic trong đất có thể tái lập quần thể hệ vi sinh vật mới cólợi cho cây trồng, đặc biệt là hệ vi sinh vật vùng rễ Cây trồng sẽ phát triển tốt ở đất, nơi

mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nâng cao được hiệu

suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ (Võ Thị Hạnh và cộng

sự, 2005).

- Trong bảo vệ môi trường: Do có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây thối (sinh

ra các loại khí H2S, SO2, NH3…) nên khi phun chế phẩm probiotic vào rác thải, cốngrãnh, chuồng trại chăn nuôi…sẽ khử mùi hôi một cách nhanh chóng Đồng thời số lượngruồi, muỗi, ve, các loại côn trùng bay khác giảm hẳn số lượng Rác hữu cơ được xử lý

EM chỉ sau một ngày có thể hết mùi và tốc độ mùn hoá diễn ra rất nhanh Trong các khobảo quản nông sản, sử dụng EM có tác dụng ngăn chặn được quá trình gây thối, mốc.Các nghiên cứu cho biết chế phẩm EM có thể giúp cho hệ vi sinh vật tiết ra các enzymphân huỷ như lignin peroxidase, enzyme amylase, protease, cellulase và đặc biệt làcellulase, hemicellulase Các enzym này có khả năng phân huỷ các hoá chất nông nghiệptồn dư, thậm chí cả dioxin Ở Belarus, việc sử dụng EM liên tục có thể loại trừ ô nhiễmphóng xạ (Teruo Higa, 2002)

1.1.3.2 Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Mặc dù chế phẩm probiotic mới được ứng dụng vào nuôi trồng thủy sản trongthời gian 10 năm trở lại đây nhưng hiệu quả của chế phẩm này là rất to lớn Hiện nay các

loài vi sinh vật: Bacillus, Lactobacilus, nhóm vi khuẩn quang dưỡng… được sử dụng

chủ yếu để sản xuất các chế phẩm này Những nghiên cứu cho thấy rằng các loài vikhuẩn này đều không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước

Cải thiện môi trường nước nuôi:

Chế phẩm probiotic được bổ sung vào môi trường nước nuôi thủy sản có tác dụngcải thiện chất lượng nước

Trong nuôi trồng thủy sản, lượng thức ăn dư thừa do động vật thủy sản hấp thụkhông hết chiếm số lượng rất lớn, đây là nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trườngnước Đặc biêt trong nuôi tôm, tôm chỉ hấp thụ được dưới 1/3 tổng lượng dinh dưỡngđầu tư vào ao nuôi (Briggs và Funge-Smith, 1994) và phần còn lại bị mất vào hệ thống

ao nuôi (Wu, 1995 và Piedrahita, 2003) Hơn nữa, các chất bài tiết từ các loài thủy sinhvào môi trường nước chiếm khoảng 70 – 80% lượng protein chúng đã tiêu hóa, phần lớn

trong số đó (80%) ở dưới dạng dễ hòa tan trong nước, đặc biệt là ammoniac (Porter và

cộng sự, 1987) Các chất thải này, bao gồm thức ăn dư thừa và các sản phẩm bài tiết, có

thể phì nhưỡng cho ao nuôi và kết quả là sự phát triển bùng nổ của tảo độc cũng như gây

ra hiện tượng thiếu ô-xy trong nước Chế phẩm probiotic được bổ sung vào môi trườngnước có chưa các vi khuẩn có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào như protease,amylase có thể phân giải các chất hữu cơ và các chất bài tiết thành CO2 và nước, chuyểncác chất độc hại như NH3, H2S, NO2 - thành các chất không độc như NO3-, NH4+, giúp

giảm mùi hôi của môi trường nước, ổn định pH và màu nước ao (Võ Thị Hạnh và cộng

sự, 2005) Các chủng vi sinh thường được sử dụng để thực hiện chức năng này gồm Bacillus sp, Nitrosomonas, Nitrobacter như vậy các vi khuẩn trong chế phẩm probiotic

co tác dụng

- Làm ổn định chất lượng nước và nền đáy trong ao nuôi tôm cá

- Giảm thiểu ô nhiễm môi trường ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gâynên

Nhiều loại chế phẩm vi sinh được sử dụng để cải thiện môi trường nước nuôitrồng thủy sản như: chế phẩm EM, BIOnAQUA 1-MV( công ty Mai Việt), BZT®Aquaculture (USA), BIO II (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2005).…

Tăng tốc độ sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho đối tượng nuôi :

Nghề nuôi trồng thủy sản đang đối mặt với các loại bệnh dịch, nguyên nhân chủ

yếu là do các loại vi khuẩn Aeromonas.sp, Pseodomonas.sp, Vibrio sp Tuy nhiên ,chúng ta hạn chế sử dụng kháng sinh để phòng bênh nên chế phẩm probiotic có vai trò

vô cùng quan trọng Hiện nay trong nuôi trồng thủy sản cũng phân lập được nhiều loại

probiotic như Carnobacterium piscicola (Hius, 1984), Lactobacillus plantarum (Schroder, 1984), Pediococcus acidilactici (Pucci, 1988 ) Các chủng vi sinh vật có thể

cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng bên trong đường ruột nhờ khả năng chịu mặn,chịu kiềm, chịu axit của đường ruột Bên cạnh đó, các chủng probiotic này càng đượcchú ý hơn nhờ khả năng sinh ra các chất ức chế (bacteriocins, sideropheres, lysozymes,hydrogen peroxides ) và tổng hợp được các hợp chất kháng sinh tương ứng như:piscicolin, plantarin, pediococin (PA - 1) có tính sát khuẩn cao, đặc biệt đối với vi khuẩn

gây bệnh như: Listeria monocytogenes (Pucci, 1988), Shigella spp và Salmonella spp…

Vì vậy khi bổ sung chế phẩm probiotic có chứa các vi sinh vật này vào thức ăn sẽ kìmhãm sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh, đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vậtđường ruột tôm cá, giúp đối tượng nuôi tăng trưởng và phát triển tốt, chống chọi đượcvới các loại bênh dịch Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng mộtlượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản Đặc biệt là hạn chế đáng kểkhả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp

tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong và cộng sự, 1998).

Bên cạnh đó chế phẩm probiotic sẽ giúp tôm cá sinh trưởng mạnh hơn do các vikhuẩn trong chế phẩm probiotic chính là nguồn cung cấp các enzyme tiêu hóa, một sốvitamin và axit béo có tác động tích cực đến quá trình chuyển hóa của cá tôm (Sakata,1990) Nhờ đó tôm cá sẽ hấp thụ thức ăn tốt hơn, có sức chống chịu với các điều kiệnmôi trường, tăng sức đề kháng

Ngoài ra, chế phẩm probiotic còn được biết với khả năng kháng virus Một sốnghiên cứu cho thấy các chủng vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có khả năng khángmột số tác nhân virus gây bệnh trên động vật thủy sản, trong đó khả năng kháng virus

gây bệnh trên trên tôm sú như IHNV (Kamei và cộng sự, 1988) và OMV (Direkbusarakom và cộng sự, 1998) Như vậy, chế phẩm probiotic còn có thể giúp cho

nuôi trồng thủy sản chống chọi với tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất là virus Đây cóthể là một ưu thế lớn cho việc sử dụng chế phẩm probiotic vào nuôi trồng thủy sản trongtương lại

1.1.4 Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics

Quy trình tạo chế phẩm probiotic :

1.1.4.1 Nguyên liệu

Chủng giống Nguyên liệu

Nhân giống

Lên men

Sinh khối

Chế phẩm dạng dịch

Chất phụ gia

Chế phẩm dạng bột

Môi trường dùng để nuôi thu sinh khối vi khuẩn cần đảm bảo đủ thành phầnchất dinh dưỡng, khoáng, chất kích thích sinh trưởng, VTM Và một yêu cầu đối vớinguyên liệu dùng để sản xuất công nghiệp là nguyên liệu phải rẻ tiền, dễ kiếm

Đối với chủng giống vi sinh vật, cần lựa chọn những chủng có đầy đủ các đặc tính mà tacần để sản xuất chế phẩm mà ta mong muốn

1.1.4.2 Nhân giống

Chủng giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC Vì vậy, khi sử dụng tacần hoạt hóa giống, bằng cách cấy chuyền sang ống thạch nghiêng, đặt trong tủ ấm 320

sau 24-48h

•Nhân giống cấp1: Chủng sau khi phát triển tốt trong ống thạch nghiêng được cấy

chuyển tiếp sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường MRS, LB, EB đối với các chủng vikhuẩn lactic, bacillus, vi khuẩn quang dưỡng Nuôi ở 370C trong 24h

•Nhân giống cấp 2: Các chủng giống cấp 1 đã phát triển tốt được cấy chuyền sang

môi trường lỏng với tỷ lệ 10% giống, trong bình tam giác Nuôi ở 370C trong 24h

•Nhân giống cấp 3: Giống cấp 2 được nhân tiếp sang thùng nhựa có thể tích lớn

hơn với tỷ lệ giống 10%, nuôi ở 370C Giống cấp 3 được dùng để lên men trong nhữngthùng lên men lớn để thu sinh khối

1.1.4.3 Thu sinh khối

Sau lên men, dịch lên men được xử lý để thu sinh khối Có các phương pháp thusinh khối như:

- Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút, nhiệt độ 40C trong 10 phút Phương phápnày chỉ được áp dụng trong phòng thí nghiệm

- Dùng màng siêu lọc Những màng này có thể lọc được vi khuẩn Hiện nayphương pháp này được áp dụng nhiều trong công nghiệp

1.1.4.4 Tạo chế phẩm

Dịch sinh khối sau khi đã xử lý được trộn với chất mang Chất mang giúp vikhuẩn có thể tồn tại lâu, nó như chất bảo quản chế phẩm Chất mang thường là khô đậutương, khô lạc, cám gạo, bột gạo, đường lactose, sucrose…

Sau khi trộn chất mang ta tiến hành sấy khô chế phẩm đến độ ẩm 8-12% để bảo quản

Có thể dùng các phương pháp sấy:

•Sấy nhiệt:

Cho chế phẩm vào thiết bị sấy bình thường ở nhiệt độ 40-500 C trong 4-5h

Ưu điểm: - Tốn ít chi phí cho thiết bị

- Hao phí cho năng lượng thấp

Nhược điểm: - Thời gian sấy kéo dài

- Không thể tự động hóa được

- Chất lượng sấy kém

•Sấy hút chân không

+ Nguyên lý làm việc: Dưới môi trường áp suất chân không, các khay chứanguyên liệu được quay đảo bên trong buồng sấy nhằm tăng hiệu suất sóng cao tần Hàm

ẩm trong nguyên liệu được gia nhiệt nhanh và bay hơi thoát ra ngoài bề mặt tăng tốc độsấy so với kiểu gia nhiệt truyền dẫn

+ Ưu điểm: Hiệu suất sấy cao, tiêu hao năng lượng ít, nhiệt độ sấy thấp nên thíchhợp với sản phẩm nhạy nhiệt

+ Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền

•Sấy chân không thăng hoa

+ Ưu điểm: Nhiệt độ sấy thấp nên bảo toàn được giá trị của sản phẩm.

+ Nhược điểm: Chi phí cho thiết bị và năng lượng cao

1.1 Tổng quan về cá chim vây vàng

1.2.1 Giới thiệu chung về cá chim vây vàng

Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepède 1801) phân bố ở miền Nam

Nhật Bản, Tây Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương, Đại Tây Dương Vùng biển nhiệt đới

và Á nhiệt đới, vùng biển Đông Nam Á và vùng biển Tây Châu Phi Ở Trung Quốcchúng phân bố vùng biển Đông Hải, Nam Hải, Hoàng Hải, vùng biển Quảng Đông,Quảng Tây, Hải Nam, Phúc Kiến Cá chim vây vàng cũng đã tìm thấy ở vùng biển nước

ta.Ở Việt Nam, cá chim vây vàng được tìm thấy trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và NamBộ

Cá chim vây vàng là loài cá nước ấm, có tập tính di cư, sống ở tầng giữa và tầngmặt Ở giai đoạn cá giống hàng năm sau mùa đông cá thường tập trung thành đàn sống ở

vùng vịnh, cửa sông Cá trưởng thành sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 22 –

280C, là loài rộng muối 3 - 33 ppt Dưới 20 ppt cá sinh trưởng nhanh, trong điều kiện độmặn cao tốc độ sinh trưởng chậm lại Nhu cầu hàm lượng oxy hòa tan lớn hơn 2,5 mg/L

Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trưởngthành có thể bắt những động vật vỏ cứng như: ngao, cua, ốc Giai đoạn cá giống thức ăn

là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia Cá con

ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ Thức ăn chính của cá trưởng thành là các loại tôm cánhỏ Cá trưởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn toàn thức ăn côngnghiệp trong nuôi thương phẩm

Cá Chim vây vàng (Trachinotus bloochi) có thịt thơm ngon, có khả năng chống

chịu dịch bệnh tốt Cá chim vây vàng là loài cá biển có giá trị kinh tế cao, được nuôinhiều ở vùng biển miền Nam Trung Quốc và một số quốc gia trên thế giới, cá đang đượctiêu thụ mạnh ở Nhật Bản, Đài Loan, Hồng Kông, Trung Quốc, Mỹ, Singapore Nước ta

có vùng biển ấm, nhiềuvùng vịnh, đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió Bên cạnh

đó, là chất lượng nước tốt, độ mặn nước biển tương đối ổn định Đây là điều kiện vôcùng thuận lợi để phát triển nghề nuôi cá chim vây vàng ở Việt Nam

1.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới và trong nước

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới

Năm 1986, ở Đài Loan, Lâm Liệt Đường đã thu gom 126 con cá chim vây vàngloại nhỏ, loại vừa và lớn nuôi chung với nhau Năm 1989, Lâm Liệt Đường lần đầu tiênsinh sản nhân tạo cá chim vây vàng thành công Năm 1991, Lâm Liệt Đường tăng thêmđàn bố mẹ cho tiến hành sinh sản nhân tạo

Năm 1993, Trung tâm chuyển giao công nghệ Trường Đại học Trung Sơn kết hợpvới Trại Nghiên cứu giống Thủy sản Quảng Đông – Trung Quốc nghiên cứu sinh sảnnhân tạo thành công giống cá chim vây vàng quy mô nhỏ (ương nuôi ấu trùng trong bể ximăng) Năm 1998, Trung tâm đã kết hợp với Công ty trách nhiệm hữu hạn giống thủysản Thắng Lợi – Hải Nam – Trung Quốc nghiên cứu sản xuất nhân tạo thành công trênquy mô lớn (ương nuôi ấu trùng trong ao đất)

Bên cạnh đó, Trung tâm phát triển nuôi biển ở Batam – Indonesia (Nur MuflichJuniyanto, Syamsul Akbat và Zakimi) đã thành công trong việc sản xuất giống nhân tạo

cá chim vây vàng, vì vậy con giống có thể được sản xuất ở địa phương vượt mức và làmgiảm áp lực khai thác giống ngoài tự nhiên

Cá chim vây vàng đã và đang được nuôi nhiều ở vùng biển miền Nam TrungQuốc và một số quốc gia trên thế giới, cá đang được tiêu thụ mạnh ở Nhật Bản, ĐàiLoan, Hồng Kông, Trung Quốc, Mỹ, Singapore

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng ở Việt Nam

Năm 2006, Trung tâm Khuyến nông Quốc gia đã phối hợp với Trường Cao đẳngThủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I thực hiện dự án nhập công nghệ sảnxuất nhân tạo cá chim vây vàng do Trung tâm chuyển giao công nghệ Trường Đại họcTrung Sơn Trung Quốc chuyển giao

Năm 2009 Khoa Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang bắt đầu thửnghiệm cho đẻ nhân tạo cá chim vây vàng tại Bè Nghiên cứu Thực nghiệm - Khoa Nuôitrồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa,sau đó ấp trứng và ương giống thành công tại Trại Sản xuất Giống cá Biển – Khoa Nuôitrồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang, tại Đường Đệ – Nha Trang

Với nguồn giống và kỹ thuật nuôi đã được chủ động sản xuất, một số vùng nuôi ởnước ta đã được chuyển giao công nghệ nuôi thương phẩm cá chim vây vàng

Đầu năm 2011, Trung tâm giống Hải sản tỉnh Nam Định đã nuôi thử nghiệmgiống cá chim biển vây vàng trong ao đất và có hiệu quả cao Bên cạnh đó, ở Quỳnh Lưu

Nghệ An đang xây dựng mô hình nuôi thương phẩm cá chim vây vàng Hiện nay cá

chim vây vàng đang được nuôi thử nghiệm ở Phú Yên, Vũng Tàu, Nha Trang … vàbước đầu đã mang lại hiệu quả

Trên thế giới và trong nước mới chỉ tập trung vào vấn đề sinh sản nhân tạo và kỹthuật nuôi cá chim trắng vây vàng, trong khi đó cá chim trắng vây vàng nuôi lồng biểnvẫn có thể đối diện với nguy cơ bệnh dịch và bị ảnh hưởng bởi các tác động từ môitrường tự nhiên Tuy nhiên từ trước đến nay, vấn đề nghiên cứu về thức ăn và bệnh dịch

trên cá chim trắng vây vàng vẩn còn bỏ ngỏ, chưa có một nghiên cứu nào về lĩnh vựcnày được công bố.

1.2.3 Tình hình bệnh dịch trên cá nuôi nước mặn nói chung và cá chim vây vàng

nói riêng

Nuôi cá biển là nghề phát triển mạnh ở Việt Nam từ 30 năm nay và đã mang lạihiệu quả kinh tế to lớn nhưng trong thời gian gần đây đang có dấu hiệu dừng lại do dịchbệnh xảy ra nhiều, nguyên nhân gây bệnh bao gồm:

1.2.3.1 Bệnh do nấm, ký sinh trùng

Nấm là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh ở cá như: Bệnh nấm thủy mi – gây ra do

do 4 giống nấm Leptolegnia, Aphanomyces, Saprolegnia và Achlya; Bệnh nấm mang gây ra bởi Branchiomyces Các loại nấm gây hại nhiều đối với nhiều loại cá nuôi giai

-đoạn cá con, cá thịt và trứng cá Nấm gây bệnh trên cá làm cho cá bị ngứa ngáy, lở loét,kém ăn Biện pháp phòng và trị hiện nay thường dùng muối ăn ( NaCl) nồng độ 2-3%sulfate đồng ( CuSO4) nồng độ 0,5g/m3 nước để tắm cho cá nuôi

Ký sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên cá biển nuôi Nguyễn Thị Muội và

Đỗ Thị Hòa (1978-1980) đã phát hiện được 80 loài ký sinh trùng ký sinh trên cá biển.

Nhiều loại ký sinh trùng như: ký sinh trùng đơn bào (Amyloodinium), ký sinh trùng bánh

xe (Trichodiniosis), và các loại sán lá đơn chủ (Monogeneansis, Neobenedenia girellae,

Benedenia epinepheli và Benedenia sp) cũng là nguyên nhân gây ra một số bệnh ở cá

nuôi Mặc dù không gây tổn thất lớn nhưng nó làm cho cá chậm lớn, giảm chất lượngthịt cá, tạo cơ hội cho vi khuẩn và virus tấn công Biện pháp phòng ngừa các bệnh do kýsinh trùng thường là giữ vệ sinh ao cá nhất là ao ương, cải tạo ao nuôi kỹ càng, thả cá

với mật độ vừa phải và tẩy giun sán định kỳ cho cá nuôi bằng thuốc

1.2.3.2 Bệnh do virus