Phân lập, tuyển chọn và đánh giá một số đặc tính của trùng Lactorbacillus

Phân lập, tuyển chọn và đánh giá một số đặc tính của trùng Lactorbacillus trên cá chim vây vàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN Lớp : 49 CNSH Khoá : 49 Nha Trang, tháng 7 năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN Lớp : 49 CNSH Khoá : 49 Nha Trang, tháng 7 năm 2011 GVHD: Th.s Lê Đình Đức http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Lê Đình Đức, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp 49SH, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 6 năm 2011 Sinh viên Lê Thanh Huân GVHD: Th.s Lê Đình Đức http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN . i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG . vi DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT . viii LỜI MỞ ĐẦU 1 1.1.1. Giới thiệu vê Probiotics 3 1.1.2. Cơ chế tác động của probiotic . 5 1.1.2.1. Sản sinh ra các chất ức chế . 5 1.1.2.2. Cạnh tranh cơ chất, năng lượng với những vi khuẩn khác . 5 1.1.2.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh 6 1.1.2.4. Tăng cường đáp ứng miễn dịch . 6 1.1.2.5. Cải thiện chất lượng nước . 7 1.1.3. Ứng dụng của probiotic 7 1.1.3.1. Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong y h ọc, trong trồng trọt, trong bảo vệ môi trường. . 7 1.1.3.2. Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 8 1.1.4. Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics. 11 1.1.4.1. Nguyên liệu 12 1.1.4.2. Nhân giống . 12 1.1.4.3. Thu sinh khối 12 1.1.4.4. Tạo chế phẩm . 12 1.1 . Tổng quan về cá chim vây vàng 14 1.2.1. Giới thiệu chung về cá chim vây vàng . 14 1.2.2. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới và trong nước 15 1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới 15 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng ở Việt Nam . 16 GVHD: Th.s Lê Đình Đức http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân iii 1.2.3. Tình hình bệnh dịch trên cá nuôi nước mặn nói chung và cá chim vây vàng nói riêng 17 1.2.3.1. Bệnh do nấm, ký sinh trùng . 17 1.2.3.2. Bệnh do virus . 18 1.2.3.3. Bệnh do vi khuẩn 18 1.2 . . Tổng quan về vi khuẩn lactic 20 1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic 20 1.3.1.1. Giới thiệu chung . 20 1.3.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic 22 1.3.1.2.1. Lên men đồng hình . 22 1.3.1.2.1. Lên men dị hình 23 1.3.2. Giới thiệu về giống Lactobacillus . 23 1.3.2.1 Giống Lactobacillus – các đặc tính của vi khuẩn probiotic 24 1.3.2.2.1 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh 24 1.3.2.2.3 Khả năng chịu mặn . 25 1.3.2.2.4 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa . 25 1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn lactic nói chung và Lactobacillus nói riêng. 26 1.3.2.1.1. Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng . 26 13.2.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy . 29 1.3.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản . 30 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu . 33 2.1.1. Mẫu cá . 33 2.1.2. Môi trường nghiên cứu . 33 2. 2. Nội dung nghiên cứu . 35 Hình 2.1:Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài . 35 GVHD: Th.s Lê Đình Đức http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân iv 2. 3. Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn 36 2.3.1.1. Phân lập Lactobacillus . 36 2.3.1.2. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Lactobacillus . 36 2.3.1.3. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio 37 2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa . 38 2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái . 38 2.3.2.1.1. Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi . 38 2.3.2.1.2. Nhuộm Gram . 38 2.3.2.2. Quan sát đặc tính sinh hóa 39 2.3.2.2.1. Khả năng sinh acid lactic 39 2.3.2.2.2. Phản ứng catalase 40 2.3.2.2.3. Khả năng di động 40 2.3.2.2.4. Khả năng sử dụng các loại đường: 41 2.3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy 41 2.3.3.1. Xác định khả năng sinh trưởng 41 2.3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp 42 2.3.3.3. Xác định thời gian nuôi cấy 42 2.3.3.4. Xác định pH thích hợp 42 2.3.4. Xác định các đặc tính probiotic . 42 2.3.4.1. Xác định khả năng sinh enzyme tiêu hóa 42 2.3.4.2. Xác định khả năng chịu mặn 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 44 3.1. Kết quả phân lập tuyển chọn 44 3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng 44 3.1.2. Kết quả tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio . 44 3.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa 46 3.2.1. Đặc điểm hình thái 46 3.2.1.1. Đặc điểm hình thái của chủng L1.2 46 GVHD: Th.s Lê Đình Đức http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân v 3.2.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng L1.3 48 3.2.2. Đặc điểm sinh hóa . 51 3.3. Đặc tính nuôi cấy và đặc tính probiotic . 52 3.3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3 52 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3 54 3.3.3. Thời gian nuôi cấy . 55 3.3.4. pH nuôi cấy 56 3.3.5. Khả năng chịu mặn của hai chủng L1.2 và L1.3 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 Kết luận 59 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 GVHD: Th.s Lê Đình Đức http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio của 5 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37 o C . 45 Bảng 3.2: Kết quả thử các đặc tính của hai chủng L1.2 và L1.3 52 GVHD: Th.s Lê Đình Đức http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân vii DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 : Cá chim vây vàng . 14 Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1, C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37 o C . 45 Hình 3.2: Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30 o C 46 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 34 0 C 47 Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X . 47 Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram của chủng L1.2 . 48 Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 34 0 C 49 Hình 3.7: Hình thái tế bào của chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X . 49 Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 . 50 Hình 3.9: Khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3 . 51 Hình 3.10: Khả năng lên men các loại đường của chủng L1.2 và L1.3 51 Hình 3.11: Mối tương quan giữa thời gian và OD 600 nm của chủng L1.2 . 53 Hình 3.12: Mối tương quan giữa thời gian và OD 600 của chủng L1.3 . 53 Hình 3.13 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 . 55 Hình 3.14: Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào sống của hai chủng L1.2 và L1.3 ở OD 600 nm. 56 Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 . 57 Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3 . 58 GVHD: Th.s Lê Đình Đức http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân viii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT [...]... các đặc tính probioic đã được áp dụng, trong đó có nhóm vi khuẩn Lactobacillus Với lí do như vậy nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Phân lập, tuyển chọn và đánh giá tiềm năng probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập trên Cá Chim vây vàng” Mục tiêu của đề tài là phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio để bổ sung vào chế phẩm probiotic nuôi cá chim vây vàng... mục đích tăng tốc độ tăng trưởng, khả năng kháng bệnh, đảm bảo sự phát triển bền vững của nghề nuôi cá chim vây vàng Các nội dung nghiên cứu của đề tài: - Phân lập các chủng Lactobacillus và Vibrio trong ruột cá chim vây vàng - Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính khảng Vibrio - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Lactobacillus - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hơp cho các chủng... môi trường sống có chứa nhiều cacbohydrat và phân bố rộng khắp trong thức ăn, thức ăn ủ chua, phân bón, sữa và các sản phẩm sữa và trong đường ruột người, động vật, thủy sản… -Nhiều loài Lactobacillus được sử dụng thương mại trong việc sản xuất các loại sữa chua, pho mát và sữa chua, và họ có một vai trò quan trọng trong sản xuất rau quả lên men (dưa chua và dưa cải bắp), đồ uống (rượu vang và nước trái... sữa người và động vật Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng lactose làm thức ăn vì chúng có khả năng sinh enzym β-galactosidase Enzym này thuỷ phân lactose thành glucose và galactose, giúp cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn được dễ dàng hơn + Sucrose cũng là một disaccarit Trong quá trình lên men dưới tác dụng của enzym sucrose hydrolase bị thuỷ phân thành glucose và fructose Vài loài... sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên cá biển nuôi Nguyễn Thị Muội và Đỗ Thị Hòa (1978-1980) đã phát hiện được 80 loài ký sinh trùng ký sinh trên cá biển Nhiều loại ký sinh trùng như: ký sinh trùng đơn bào (Amyloodinium), ký sinh trùng bánh xe (Trichodiniosis), và các loại sán lá đơn chủ (Monogeneansis, Neobenedenia girellae, Benedenia epinepheli và Benedenia sp) cũng là nguyên nhân gây ra một số. .. bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004) Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V alginolyticus, và V anguillarum (Phan Thị Vân và cộng sự, 2000) Ngoài ra có những thông báo khác... ngăn cản sự khu trú và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Người ta đã chứng minh khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt ruột của Lactobacillus GG và Lactobacillus plantarum 299V để ngăn cản sự phát triển và lây lan của vi khuẩn Escherichia coli 0157H7 gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật nuôi (Mack DR, Michail S, Wei S, Macdougal L, Hollingsworth MA, 1999) Ngoài ra một số vi khuẩn thuộc giống... nước trái cây), bánh mì bột chua, và một số xúc xích Ngày nay Lactobacillus được sử dụng trong chế phẩm probiotic cho cả con người và vật nuôi Đặc biệt, trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản chế phẩm probiotic đang được phát triển và ứng dụng ngày càng rộng rãi 1.3.2.1 Giống Lactobacillus – các đặc tính của vi khuẩn probiotic 1.3.2.2.1 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây... Vibrio, Clostridium, Candida albicans, và một số virus khác nữa (O’Sullivan và Kullen, 1998) 1.3.2.2.3 Khả năng chịu mặn Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho NTTS ở các vùng khác nhau Một số chủng Lactobacillus đã được biết... toàn được giá trị của sản phẩm + Nhược điểm: Chi phí cho thiết bị và năng lượng cao 1.1 Tổng quan về cá chim vây vàng 1.2.1 Giới thiệu chung về cá chim vây vàng Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepède 1801) phân bố ở miền Nam Nhật Bản, Tây Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương, Đại Tây Dương Vùng biển nhiệt đới và Á nhiệt đới, vùng biển Đông Nam Á và vùng biển Tây Châu Phi Ở Trung Quốc chúng phân bố vùng . Phân lập, tuyển chọn và đánh giá tiềm năng probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập trên Cá Chim vây vàng” Mục tiêu của đề tài là phân lập, tuyển. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng