2.1.1. Mẫu cá
Chúng tôi sử dụng các mẫu cá vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) khỏe, đã trải qua một số dịch bệnh. Cá chim được lấy về từ trại cá Trường Đại học Nha Trang (Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa). Mẫu để phân lập là toàn bộ ruột cá.
2.1.2. Môi trường nghiên cứu
+ Alkaline Peptone Water (APW): Peptone NaCl Nước cất 10g 10g 1 lít
Điều chỉnh pH môi trường đạt 8,5 ± 0,2. Hấp ở 1210C trong 10 phút. + MRS:
Casein peptone, tryptic digest 10, cao thịt - 10, cao nấm men - 5, glucose -20. Tween 80, K2HPO4 - 2, Na-acetate - 5, (NH4)2 citrate - 2.00, MgSO4 . 7 H2O - 0.20, MnSO4 . H2O - 0.05, nước 1000 ml, pH to 6.2 - 6.8. Khử trùng 1210C trong 15 phút.
Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,5, sau đó thêm agar vào. Hấp khử trùng ở
121oC trong 15 phút.
+ Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS): Cao nấm men Peptone Sucrose= Sodium thiosulfate.75H2O Sodium citrate.72H2O Sodium cholate 5g 10g 20g 10g 10g 3g
Oxgall NaCl Ferric citrate Bromothymol blue Thymol blue Agar Nước cất 5g 10g 1g 0,04g 0,04g 15g 1 lít
Cho các chất vào nước cất đã làm ấm và đun nóng để hòa tan. Chỉđể vừa sôi rồi nhấc ra ngay. Không hấp khử trùng. Để nguội đến 50oC rồi đổđĩa.
2. 2. Nội dung nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được sơđồ hóa trong hình 2.1
Hình 2.1:Sơđồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài
Khả năng chịu mặn Khả năng sinh axit lactic Phân lập Lactobacillus Mẫu nội tạng cá chim vây vàng Khả năng di động, phản ứng catalase Khả năng lên men đường Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio spp. Xác định đặc tính sinh lý – sinh hóa Xác định các đặc tính probiotic và điều kiện nuôi cấy thích hợp Kết luận Hình thái khuẩn lạc Soi tươi Nhuộm Gram Nhiệt độ pH Thời gian Khả năng sinh enzyme amylase, protease
2. 3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn 2.3.1.1. Phân lập Lactobacillus 2.3.1.1. Phân lập Lactobacillus
Phân lập các chủng Lactobacillus trên nội tạng của cá chim vây vàng trên môi trường MRS.
Cân 5g mẫu nội tạng của cá chim vây vàng cho vào túi nilon, bổ sung 45 ml canh thang tăng sinh để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher trong 1 phút. Sau đó cho vào bình tam giác và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau 24h
đem pha loãng thành các nồng độ 10-2 đến 10-7. Hút 0,1 ml mẫu (Trần Linh Thước, 2008) từ ba nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 cho vào môi trường thạch dinh dưỡng đã chuẩn bị
trong các đĩa petri vô trùng và dùng que cấy trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Các thao tác pha loãng, đổ đĩa thạch và cấy mẫu được làm trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để các
đĩa petri đã cấy mẫu vào tủ ấm 370C trong 1 – 2 ngày. Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc để lựa chọn sơ bộ các loài thuộc chi Lactobacillus . Chúng được tách ra cấy ria nhiều lần để chọn các dòng thuần chủng, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.3.1.2. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Lactobacillus
Trong sản suất, nghiên cứu, việc hoạt hoá giống và thường xuyên kiểm tra chất lượng của giống là hết sức cần thiết. Để hoạt hóa giống người ta thường sử dụng môi trường nuôi cấy giàu các chất kích thích sinh trưởng như: cao nấm men, nước chiết cà chua, hỗn hợp vitamin, axit béo,… Vì vậy việc chon phương pháp giữ giống có vai trò quan trọng trong duy trì được những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hoá giống và không làm mất hoạt tính. Quá trình tiến hành giữ giống:
- Sau khi phân lập được nhiều chủng Lactobacillus chúng tôi sẽ tiến hành giữ
giống trên môi trường thạch nghiêng: chọn các đĩa petri có chứa khuẩn lạc thuần chủng, dùng que cấy ria chọn lấy các khuẩn lạc và cấy ria trên môi trường agar MRS
trong các ống thạch nghiêng đã được chuẩn bị trước. Các ống được bảo quản ở nhiệt độ
4 – 6oC. Định kỳ cấy truyền giống, 2 – 3 tháng cấy truyền lại một lần.
- Sau khi xác định được các đặc tính probiotic của các chủng vừa phân lập
được, chúng ta sẽ tiến hành giữ giống trong môi trường MRS lỏng có chứa từ 30 – 50 % glycerol về thể tích: Các chủng Lactobacillus sau khi đã tuyển chọn sẽ được nuôi cấy ở môi trường MRS lỏng, ở 28 -300C, lắc 180 vòng/phút cho đến khi đạt đến thời gian ở giữa pha Logarit của đường cong sinh trưởng . Hút dịch nuôi cấy cho vào ống eppendoff có chứa glycerol với tỷ lệ từ 30 – 50 % thể tích của ống, votex các ống đã hút, cho vào tủ lạnh ở 4 -6 0C khoảng 30 phút trước khi đem bảo quản ở tủ đông sâu – 700C. Phương pháp bảo quản trong glycerol này cho phép chúng ta có thể giữ giống trong thời gian dài từ 6 tháng đến 1 năm.
2.3.1.3. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio
Các chủng Vibrio được sử dụng được lấy từ bộ sưu tập của phòng thí nghiệm và phân lập từ trên đối tượng cá chim vây vàng.
Từ môi trường giữ giống, các chủng Lactobacillus và Vibrio được đưa vào môi trường lỏng tương ứng (Lactobacillus nuôi trên môi trường MRS, Vibrio nuôi trên môi trường APW) và nuôi hoạt hóa qua đêm ở 370C. Khi mật độ tế bào của Vibrio đạt khoảng 104 CFU ml-1 và mật độ tế bào Lactobacillus đạt khoảng 105 CFU ml-1 thì
Vibrio được trang đều trên bề mặt đĩa thạch chứa môi trường LB đã chuẩn bị sẵn (Ravi và cs, 2007). Sau đó đục các lỗ thạch đường kính khoảng 5 mm, hút 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus cho vào các lỗ khoan (Sarker và cs, 2008). Đem các đĩa đã cấy vào tủ ấm 370C, sau 1 – 2 ngày quan sát các vòng kháng khuẩn và xác định đường kính của nó.
Để chọn lựa được các chủng Lactobacillus kháng lại Vibrio có độ tin cây cao thì chúng ta tiến hành qua 2 – 3 vòng thử đối kháng. Vòng 1 tiến hành thử đối kháng tất cả các chủng Lactobacillus với 2 -3 chủng vibrio để tuyển chọn sơ bộ được các chủng có khẳ năng kháng. Tiếp theo sử dụng các chủng đã tuyển chọn lần 1 để thử khả
năng đối kháng với 3-4 chủng vibrio, từđó chọn ra các chủng có hoạt tính kháng mạnh
để làm các bước tiếp theo.
2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa 2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái 2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái
2.3.2.1.1. Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi
- Chuẩn bị mẫu tế bào vi khuẩn.
Các chủng Lactobacillus lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30 0C. Sau 24h nuôi cấy, canh trường được thu nhận để làm tiêu bản quan sát tế bào vi khuẩn (ở trạng thái sống và nhuộm Gram).
- Chuẩn bị tiêu bản
Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle) được rửa sạch với xà bông, làm khô và ngâm trong cồn 950. Tạo tiêu bản giọt ép - quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống: nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật lên phiến kính. Đặt lá kính lên giọt nước (cẩn thận để
không tạo bọt nước bằng cách nghiêng lá kính một góc 450 và từ từ hạ xuống). - Soi kính hiển vi
Trường hợp quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống (sử dụng vật kính 10X và 40X): đặt tiêu bản lên bàn mẫu. Hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng. Chọn vật kính 10X, dùng nút chỉnh thô nâng bàn mẫu sao cho vật kính tiếp xúc với phiến kính. Chỉnh từ từ
theo chiều ngược lại cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật trong thị trường. Dùng bộ phận di chuyển bàn mẫu sao cho vùng muốn quan sát nằm giữa thị trường. Chuyển sang vật kính 40X, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh.
2.3.2.1.2. Nhuộm Gram
Vi khuẩn Lactic Gram (+), có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài, dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn Lactic còn có hình cầu hoặc cầu trực khuẩn, dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi.
Tiến hành:
•Bước 1: Cho một giọt canh trường chứa vi khuẩn lên phiến kính sạch, dàn đều và để khô tự nhiên hoặc hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn (tránh không cho ngọn lửa trực tiếp trên vết mẫu).
•Bước 2: Nhỏ một giọt chất nhuộm Violet lên vết mẫu đã được cố định trong vòng 1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất.
•Bước 3: Nhỏ một giọt dịch cắm màu lugol lên vết mẫu trong vòng 30 giây đến 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất.
•Bước 4: Dùng cồn 950 tia qua lại trên vết mẫu và phiến kính đến khi hết màu (khoảng 15 giây), sau đó rửa ngay bằng nước cất.
•Bước 5: Nhỏ một giọt chất màu fucshin lên vết mẫu trong khoảng 1 phút, sau
đó rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu.
Sử dụng vật kính 100X, đặt tiêu bản đã nhuộm Gram lên bàn mẫu và nhỏ một giọt dầu lên vết nhuộm. Nâng tụ quang, mở chắn sáng. Nhìn vào mẫu (từ ngoài) và hạ
từ từ vật kính 100X sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu. Nhìn vào thị kính, dùng nút chỉnh thô điều chỉnh đến khi thoáng nhìn thấy ảnh thì dừng lại. Sau đó, dùng nút chỉnh tinh cho đến khi nhìn thấy ảnh rõ nét.
2.3.2.2. Quan sát đặc tính sinh hóa 2.3.2.2.1. Khả năng sinh acid lactic 2.3.2.2.1. Khả năng sinh acid lactic
• Phương pháp định tính: có 2 cách
Nuôi vi khuẩn trong hộp petri trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 với lượng 10 g/l. Khi khuẩn lạc mọc, nếu chủng có sinh axit lactic thì xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải. Ngược lại là chủng không sinh axit lactic.
Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml phenol, thêm từ từ từng giọt FeCl3 1% cho đến khi dung dịch có màu tím của phức phenol-sắt. Sau đó, cho vào dịch nghiên cứu. Nếu màu tím chuyển thành màu vàng thì trong dịch nuôi có mặt axit lactic.
2.3.2.2.2. Phản ứng catalase
- Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của men catalase.
- Cơ sở sinh hóa: Do oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang tính độc
đối với vi sinh vật, không có gì ngạc nhiên là vi sinh vật cũng có thể tự “giải độc” bằng cách tạo ra những men có khả năng phá hủy một số sản phẩm chứa oxy như vậy. Điển hình của loại men này là catalase. Men catalase có ở hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa cytochrome.
- Phương pháp thử: Thử trên lam: Dùng que cấy lấy tâm khuẩn lạc thuần đã nuôi trên môi trường MRS đặc đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khuẩn lạc nằm trên lam kính. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có enzym catalase trong tế bào.
- Lưu ý:
+ Khi thử nghiệm trên lam không được đảo trộn trình tự tiến hành ( không đưa H2O2 lên lam kính trước vi sinh vật) bởi cả sắt lẫn platinum co trong que cấy đều có thể gây phản ứng dương tính giả.
+ Nên dùng các khuẩn lạc đã nuôi trong thời gian 18 – 24 giờ vì những khuẩn lạc già hơn có thể gây mất hoạt tính catalase và gây phản ứng âm tính giả. + H2O2 30% rất không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng nên cần giữ lạnh dung dịch và cần kiểm tra hoạt tính trước khi dùng.
2.3.2.2.3. Khả năng di động
Chủng Lactobacillus được cấy đâm sâu trong môi trường thạch đứng. Chuẩn bị
các ống nghiệm chứa môi trường MRS đặc, cao 5 - 6cm. Dùng que cấy đầu nhọn chấm vào dịch nuôi rồi đâm sâu thẳng xuống ống thạch đứng chứa môi trường MRS rắn. Nuôi ở 30 – 350C trong 2 ngày đem ra quan sát.
Nếu vi khuẩn mọc dọc theo vết cấy và mọc lan ra xung quanh, chứng tỏ chủng có khả năng di động.
Vi khuẩn mọc trên bề mặt ống thạch chứng tỏ chủng hô hấp hiếu khí.
2.3.2.2.4. Khả năng sử dụng các loại đường:
Sử dụng môi trường cơ bản gồm có:Cao thịt- 3 g; Pepton- 10 g; NaCl- 5 g; phenol đỏ – 0,03g; thêm nước cất đến 1000 ml. Bổ sung đường với nồng độ 0,5% và chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 10 phút ở 121 0C. Đường arabinose, xylose, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ
sung vào môi trường.
Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị sẽ chuyển màu vàng lục.
Các loại đường được kiểm tra là: glucose, lactose, mantose, manitol, saccarose, sucrose.
2.3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy 2.3.3.1. Xác định khả năng sinh trưởng
Chủng Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở 20 -300C, lắc 180 vòng/phút. Tiến hành lấy mẫu lúc đầu và sau 3h nuôi cấy để xây dụng đường cong sinh trưởng bằng phương pháp đo độđục (∆OD600).
Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Giá trị OD (optical density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trưởng càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 500 – 610 nm.
Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy Lactobacillus bằng máy quang phổ. Cho môi trường vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 600 nm, đưa về giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy Lactobacillus cho vào cuvet số 2 và cho vào máy
đo, đọc kết quả hiện trên màn hình.
2.3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm 2/3 thể tích bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10 %. Tiến hành nuôi cấy hai chủng
Lactobacillus ở các mức nhiệt độ 300, 330, 370, 400. Cứ sau 12 giờ và 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đo pH và OD600 nm.
2.3.3.3. Xác định thời gian nuôi cấy
Sau khi chọn được nhiệt độ thích hợp cho từng chủng Lactobacillus ta tiến hành thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thu sinh khối tối ưu cho từng chủng. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm khoảng 2/3 bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10%. Tiến hành đo pH và OD600 sau 0, 8, 12, 16, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 giờ nuôi cấy.
2.3.3.4. Xác định pH thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng với lượng môi trường khoảng 2/3 thể tích bình nuôi cấy. Chỉnh pH môi trường vềở các mức pH = 4, 5, 6, 7, 8 và cho 10 % giống vào nuôi cấy ở nhiệt độ và pH thích hợp đã được chọn. Tiến hành đo pH và OD600 sau 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32h nuôi cấy.
2.3.4. Xác định các đặc tính probiotic
2.3.4.1. Xác định khả năng sinh enzyme tiêu hóa
Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng, lắc 180 vòng/phút, sau 16 – 24 h tiến hành thu dich lọc bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút và xác định hoạt tính các enzyme theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với enzyme protease và tinh bột với
enzymeamylase. Chuẩn bị môi trường trong nước cất rồi phân phối vào đĩa peptri. Sau khi thạch đông, khoét những lỗ nhỏ đường kính 0,5 cm trên mặt thạch, cho vào 0,1 ml