2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái
2.3.2.1.1. Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi
- Chuẩn bị mẫu tế bào vi khuẩn.
Các chủng Lactobacillus lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30 0C. Sau 24h nuôi cấy, canh trường được thu nhận để làm tiêu bản quan sát tế bào vi khuẩn (ở trạng thái sống và nhuộm Gram).
- Chuẩn bị tiêu bản
Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle) được rửa sạch với xà bông, làm khô và ngâm trong cồn 950. Tạo tiêu bản giọt ép - quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống: nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật lên phiến kính. Đặt lá kính lên giọt nước (cẩn thận để
không tạo bọt nước bằng cách nghiêng lá kính một góc 450 và từ từ hạ xuống). - Soi kính hiển vi
Trường hợp quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống (sử dụng vật kính 10X và 40X): đặt tiêu bản lên bàn mẫu. Hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng. Chọn vật kính 10X, dùng nút chỉnh thô nâng bàn mẫu sao cho vật kính tiếp xúc với phiến kính. Chỉnh từ từ
theo chiều ngược lại cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật trong thị trường. Dùng bộ phận di chuyển bàn mẫu sao cho vùng muốn quan sát nằm giữa thị trường. Chuyển sang vật kính 40X, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh.
2.3.2.1.2. Nhuộm Gram
Vi khuẩn Lactic Gram (+), có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài, dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn Lactic còn có hình cầu hoặc cầu trực khuẩn, dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi.
Tiến hành:
•Bước 1: Cho một giọt canh trường chứa vi khuẩn lên phiến kính sạch, dàn đều và để khô tự nhiên hoặc hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn (tránh không cho ngọn lửa trực tiếp trên vết mẫu).
•Bước 2: Nhỏ một giọt chất nhuộm Violet lên vết mẫu đã được cố định trong vòng 1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất.
•Bước 3: Nhỏ một giọt dịch cắm màu lugol lên vết mẫu trong vòng 30 giây đến 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất.
•Bước 4: Dùng cồn 950 tia qua lại trên vết mẫu và phiến kính đến khi hết màu (khoảng 15 giây), sau đó rửa ngay bằng nước cất.
•Bước 5: Nhỏ một giọt chất màu fucshin lên vết mẫu trong khoảng 1 phút, sau
đó rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu.
Sử dụng vật kính 100X, đặt tiêu bản đã nhuộm Gram lên bàn mẫu và nhỏ một giọt dầu lên vết nhuộm. Nâng tụ quang, mở chắn sáng. Nhìn vào mẫu (từ ngoài) và hạ
từ từ vật kính 100X sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu. Nhìn vào thị kính, dùng nút chỉnh thô điều chỉnh đến khi thoáng nhìn thấy ảnh thì dừng lại. Sau đó, dùng nút chỉnh tinh cho đến khi nhìn thấy ảnh rõ nét.
2.3.2.2. Quan sát đặc tính sinh hóa 2.3.2.2.1. Khả năng sinh acid lactic 2.3.2.2.1. Khả năng sinh acid lactic
• Phương pháp định tính: có 2 cách
Nuôi vi khuẩn trong hộp petri trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 với lượng 10 g/l. Khi khuẩn lạc mọc, nếu chủng có sinh axit lactic thì xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải. Ngược lại là chủng không sinh axit lactic.
Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml phenol, thêm từ từ từng giọt FeCl3 1% cho đến khi dung dịch có màu tím của phức phenol-sắt. Sau đó, cho vào dịch nghiên cứu. Nếu màu tím chuyển thành màu vàng thì trong dịch nuôi có mặt axit lactic.
2.3.2.2.2. Phản ứng catalase
- Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của men catalase.
- Cơ sở sinh hóa: Do oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang tính độc
đối với vi sinh vật, không có gì ngạc nhiên là vi sinh vật cũng có thể tự “giải độc” bằng cách tạo ra những men có khả năng phá hủy một số sản phẩm chứa oxy như vậy. Điển hình của loại men này là catalase. Men catalase có ở hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa cytochrome.
- Phương pháp thử: Thử trên lam: Dùng que cấy lấy tâm khuẩn lạc thuần đã nuôi trên môi trường MRS đặc đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khuẩn lạc nằm trên lam kính. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có enzym catalase trong tế bào.
- Lưu ý:
+ Khi thử nghiệm trên lam không được đảo trộn trình tự tiến hành ( không đưa H2O2 lên lam kính trước vi sinh vật) bởi cả sắt lẫn platinum co trong que cấy đều có thể gây phản ứng dương tính giả.
+ Nên dùng các khuẩn lạc đã nuôi trong thời gian 18 – 24 giờ vì những khuẩn lạc già hơn có thể gây mất hoạt tính catalase và gây phản ứng âm tính giả. + H2O2 30% rất không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng nên cần giữ lạnh dung dịch và cần kiểm tra hoạt tính trước khi dùng.
2.3.2.2.3. Khả năng di động
Chủng Lactobacillus được cấy đâm sâu trong môi trường thạch đứng. Chuẩn bị
các ống nghiệm chứa môi trường MRS đặc, cao 5 - 6cm. Dùng que cấy đầu nhọn chấm vào dịch nuôi rồi đâm sâu thẳng xuống ống thạch đứng chứa môi trường MRS rắn. Nuôi ở 30 – 350C trong 2 ngày đem ra quan sát.
Nếu vi khuẩn mọc dọc theo vết cấy và mọc lan ra xung quanh, chứng tỏ chủng có khả năng di động.
Vi khuẩn mọc trên bề mặt ống thạch chứng tỏ chủng hô hấp hiếu khí.
2.3.2.2.4. Khả năng sử dụng các loại đường:
Sử dụng môi trường cơ bản gồm có:Cao thịt- 3 g; Pepton- 10 g; NaCl- 5 g; phenol đỏ – 0,03g; thêm nước cất đến 1000 ml. Bổ sung đường với nồng độ 0,5% và chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 10 phút ở 121 0C. Đường arabinose, xylose, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ
sung vào môi trường.
Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị sẽ chuyển màu vàng lục.
Các loại đường được kiểm tra là: glucose, lactose, mantose, manitol, saccarose, sucrose.
2.3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy 2.3.3.1. Xác định khả năng sinh trưởng
Chủng Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở 20 -300C, lắc 180 vòng/phút. Tiến hành lấy mẫu lúc đầu và sau 3h nuôi cấy để xây dụng đường cong sinh trưởng bằng phương pháp đo độđục (∆OD600).
Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Giá trị OD (optical density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trưởng càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 500 – 610 nm.
Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy Lactobacillus bằng máy quang phổ. Cho môi trường vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 600 nm, đưa về giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy Lactobacillus cho vào cuvet số 2 và cho vào máy
đo, đọc kết quả hiện trên màn hình.
2.3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm 2/3 thể tích bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10 %. Tiến hành nuôi cấy hai chủng
Lactobacillus ở các mức nhiệt độ 300, 330, 370, 400. Cứ sau 12 giờ và 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đo pH và OD600 nm.
2.3.3.3. Xác định thời gian nuôi cấy
Sau khi chọn được nhiệt độ thích hợp cho từng chủng Lactobacillus ta tiến hành thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thu sinh khối tối ưu cho từng chủng. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm khoảng 2/3 bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10%. Tiến hành đo pH và OD600 sau 0, 8, 12, 16, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 giờ nuôi cấy.
2.3.3.4. Xác định pH thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng với lượng môi trường khoảng 2/3 thể tích bình nuôi cấy. Chỉnh pH môi trường vềở các mức pH = 4, 5, 6, 7, 8 và cho 10 % giống vào nuôi cấy ở nhiệt độ và pH thích hợp đã được chọn. Tiến hành đo pH và OD600 sau 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32h nuôi cấy.
2.3.4. Xác định các đặc tính probiotic
2.3.4.1. Xác định khả năng sinh enzyme tiêu hóa
Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng, lắc 180 vòng/phút, sau 16 – 24 h tiến hành thu dich lọc bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút và xác định hoạt tính các enzyme theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với enzyme protease và tinh bột với
enzymeamylase. Chuẩn bị môi trường trong nước cất rồi phân phối vào đĩa peptri. Sau khi thạch đông, khoét những lỗ nhỏ đường kính 0,5 cm trên mặt thạch, cho vào 0,1 ml dung dịch lọc, giữ trong tủ ấm. Sau 24 h đổ lugol và đo đường kính phần môi trường trong suốt không bắt màu với lugol. Biểu diễn hoạt tính tương đối của enzyme bằng số
mm đường kính vòng thủy phân.
Hoạt tính tương đối enzyme (H) xác định theo công thức: H = D – d (cm) D: Đường kính vòng phân giải cộng đường kính lỗ khoan.
d: Đường kính lỗ khoan.
2.3.4.2. Xác định khả năng chịu mặn
Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở các nồng độ muối NaCl khác nhau, lắc ở 180 vòng/phút, 370C trong 24h. kiểm tra khả năng sống sót của hai chủng Lactobacillus bằng giá trị OD600 nm.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập tuyển chọn
3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng
Các mẫu cá chim vây vàng được từ trại cá Trường Đại học Nha Trang tại Vũng Ngán (Nha Trang – Khánh Hòa), chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 11 chủng
Lactobacillus. Phân lập và thuần khiết Lactobacillusđã được tiến hành trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37oC. Các chủng Lactobacillus được đặt tên theo thứ tự L1.1, L1.2, L1.3, L1.4, L1.5, L2.1, L2.2, L2.3, L2.4, L2.5, L2.6.
3.1.2. Kết quả tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio
Các chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường lỏng MRS, lắc với tốc độ
180 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28-30oC). Các chủng Vibrio được tiến hành đồng thời, nuôi trên môi trường APW, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28-30oC). Tiến hành thử hoạt tính kháng Vibrio của Lactobacillus sau khi các chủng Lactobacillus và
Vibrio đã được nuôi khoảng 18 – 22 giờ. Trang đều 0,1ml chủng Vibrio lên bề mặt đĩa thạch MRS, đục các lỗ có đường kính 5 mm lên môi trường đã cấy Vibrio và cho 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus vào lỗ thạch. Các đĩa petri được ủ ở nhiệt độ
37oC trong tủ ấm.
Tính đối kháng của các chủng Lactobacillus được đánh giá thông qua kích thước vòng kháng khuẩn (D – d, mm), trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn, d là đường kính lỗ thạch. Sau 1 – 2 ngày nuôi cấy, các đĩa nuôi cấy được đem ra đọc kết quả. Kết quảđược thể hiện ở từ bảng 3.1 và hình 3.1:
0 5 10 15 20 25 L 1.2 L 1.3 L 1.4 L 1.5 L 2.2 Chủng Lactobacillus Ho ạ t t ính k h á ng Vi b ri o D - d (m m ) V 2.1 V 2.2 V 2.3 V 2.4 C 1 C 7 C 23
Bảng 3.1: Hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio của 5 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37oC
D – d (mm) V 2.1 V 2.2 V 2.3 V 2.4 C 1 C 7 C 23 L 1.2 15 14 20 18 15 22 20 L 1.3 18 16 14 22 10 24 21 L 1.4 11.5 16 13 12 10 13.5 17 L 1.5 10 14.5 16.5 10 12 11 18.5 L 2.2 13 14 16 12.5 13 10 10.5 Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1, C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định bằng
Hình 3.2:Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC
. Kết quả từ bảng 3 cho thấy có 5 chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng
Vibrio, chiếm 45,45%. Qua bảng 3, hình 3.1 và hình 3.2 cho thấy chủng Lactobacillus L1.2 và L1.3 có khả năng kháng Vibrio mạnh nhất, thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất. Từ kết quả trên chúng tôi chọn hai chủng L1.2 và L1.3 để làm các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa 3.2.1. Đặc điểm hình thái 3.2.1. Đặc điểm hình thái
3.2.1.1. Đặc điểm hình thái của chủng L1.2
Chủng L1.2được cấy trang trên môi trường MRS bổ sung agar 2%, để trong tủ ấm 370C. Sau 24h nuôi, lấy đĩa petri ra quan sát hình thái khuẩn lạc.
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C
Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X
L1.2
Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram của chủng L1.2
Kết quả cho thấy: Chủng L1.2 có khuẩn lạc tròn, có đỉnh nhọn, màu trắng nhạt, khuẩn lạc sau 24 h nuôi cấy có kích thước khoảng 2mm.
Khi làm tiêu bản soi tươi và nhuộm gram quan sát hình thái tế bào của chủng L1.2, kết quả trên hình 3.4 và hình 3.5: tế bào có dạng hình cầu, đứng đơn, xếp chuỗi, tụ thành đám. Tế bào bắt màu tím của thuốc nhuộm gram, điều đó chứng tỏ chủng LP2 là vi khuẩn gram dương.
3.2.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng L1.3
Chủng L1.3 được cấy trang trên môi trường MRS bổ sung agar 2%, để trong tủ ấm 370C. Sau 24h nuôi, lấy đĩa petri ra quan sát hình thái khuẩn lạc.
Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C
Hình 3.7: Hình thái tế bào của chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X
L1.3
Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3
Kết quả nuôi cho thấy:
Chủng L1.3 có khuẩn lạc tròn, có màu trắng đục sữa, bề mặt trơn bóng, kích thước khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy khoảng 2,2 mm.
Chủng L1.3 Tế bào có dạng hình que dài 1-2μm, đứng đơn, xếp đôi, tạo chuỗi, bắt màu tím của thuốc nhuộm gram. Kết luận chủng L1.3 là trực khuẩn, gram dương.
3.2.2. Đặc điểm sinh hóa
Song song với các thí nghiệm xác định đặc điểm hình thái của 2 chủng, chúng tôi đồng thời tiến hành kiểm tra khả năng sinh axit lactic, khả năng tạo catalase, khả
năng di động của 2 chủng L1.2 và L1.3. Thử catalase bằng cách nhỏ H2O2 vào khuẩn lạc, không thấy sủi bọt là catalase âm tính. Thử khả năng sinh axit lactic bằng phương pháp cho tạo phức với phenol. Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp cấy đâm sâu trên môi trường thạch đứng. Kết quả thử nghiệm khả năng di động được thể hiện trên hình 3.9; hình 3.10 và khả năng lên men các lọai đường ở bảng 3.2:
Hình 3.9: Khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3
L1.2 L1.3
Bảng 3.2: Kết quả thử các đặc tính của hai chủng L1.2 và L1.3
Kết quả thí nghiệm cho thấy L1.2 và L1.3: là những vi khuẩn có sinh axit lactic, gram dương, catalase âm tính, không di động, không tạo bào tử.
Theo khóa phân loại Bergey có thể kết luận 2 chủng L1.2 và L1.3 đều là những vi khuẩn lactic.
Hai chủng L1.2 và L1.3 được lựa chọn này sẽ đem đi là các thí nghiệm tiếp