1.3.1.1. Giới thiệu chung
xuất axit lactic và các loại muối của axit lactic. Ngay từ năm 1780 nhà hóa học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau (1878) Lister đã phân lập
được vi khuẩn lactic và đăt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococus lactic ) và ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã hình thành từ năm 1881.
Những vi khuẩn gây lên men lactic được gọi là vi khuẩn lactic, chúng có thể lên men được các loại đường monosacarit, disacarit nhưng không lên men được tinh bột.
Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu ( hoặc oval) và hình que, đường kính của các dạng lactic thường từ 0.5 – 1.5 µm, các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic khoảng 1 – 8 µm, trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi. Tất cả các vi khuẩn lactic đều không chuyển động, không sinh bào tử, G+, kỵ khí tùy tiện vi hiếu khí. Trực khuẩn thường nhạy cảm hơn so với liên cầu khuẩn. Vi khuẩn lactic lên men được monosaccarit và disaccarit nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men được bất kỳ loại disaccarit nào, một số không lên men được saccaroza, một số không sử dụng được latose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột ( trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccarit khác.
Khả năng tạo thành axit lactic của các loài vi khuẩn lactic khác nhau thi rất khác nhau và như vậy độ bền với axit này cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic
đồng hình tạo được axit lactic cao, các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH = 3,8 – 4 còn cầu khuẩn không thể phát triển trên môi trường này, hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn là ở pH = 5 – 6.
Đa số vi khuẩn lactic đặc biệt là trực khuẩn lactic đồng hình rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương
đối đầy đủ các axit amin hoặc các hợp chất Nitơ phức tạp hơn. Ngoài ra chúng còn có nhu cầu về vitamin ( B1, B6 , PP, các axit pantotenic, axit folic …). Vì vậy môi trường
vitamin cho nên nhiều chủng vi khuẩn lactic được dùng trong phân tích hai dạng hợp chất này ở các cơ chất khác nhau.
Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptit, axit amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn.
Vi khuẩn lactic chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vận sống được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 – 10 % NaCl.
Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 – 350C, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 450C, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ
tương đối thấp ( <= 50C). Khi gia nhiệt đến 60 – 800C thì hầu hết bị chết sau 10 – 30 phút.
Một số vi khuẩn lactic có khẳ năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả
năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm. Như vậy ngoài khẳ năng tạo ra axit lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh ( Bacterioxin).
Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp trong không khí, đất, nước nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm thực phẩm (rau quả, sữa, thịt,…) một số tìm thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật.
1.3.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic
Người ta dựa vào quá trình lên men chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình.
1.3.1.2.1. Lên men đồng hình
- Lactobacterium casei: đây là những trực khuẩn rất ngắn gây chua sữa tự nhiên. Yếm khí tuỳ tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8 ÷ 1% axit lactic. Ởđiều kiện bình thường gây chua sữa trong vòng 10 đến 12 giờ. Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 100C, tối
- Streptococcus cremoris: Thường tạo thành chuỗi dài, thường phát triển ở nhiệt
độ thấp hơn Lactobacterium casei, tối ưu từ 250C ÷ 300C, lên men glucose, galactose. - Lactobacterium bulgaricus: đây là trực khuẩn rất dài, nhiệt độ phát triển tối ưu là 200C, có khả năng lên men glucose, lactose. Có khả năng tạo độ axit cao (3,7% axit lactic).
- Lactobacterium delbruckii: thường gặp trên hạt đại mạch, đây là trực khuẩn lớn. Trong quá trình phát triển của mình chúng có khả năng tạo thành sợi. Nhiệt độ tối
ưu cho chúng phát triển từ 45 ÷ 500C, khác với các loài khác chúng không có khả năng lên men đường lactose vì vậy chúng không được dùng trong chế biến sữa.
- Lactobacterium cueumeris fermenti: thường tìm thấy chúng trong sữa ủ chua. Là trực khuẩn không chuyển động, thường tạo thành tế bào đơn và có khi tạo thành chuỗi. Thường chúng tạo thành chuỗi trong quá trình lên men. Khả năng tạo axit tối đa trong môi trường từ 0,9 ÷ 1,2%.
1.3.1.2.1. Lên men dị hình
- Streptobacterium hassice fermentatae: thường thấy chúng trong các dịch lên men chua rau cải. Chúng tồn tại từng tế bào riêng biệt hoặc ghép thành từng đôi, hoặc chuỗi ngắn có khi ghép thành từng chuỗi dài hình sợi. Khi lên men rau cải chua tạo thành axit lactic, axit axetic, rượu etylic và CO2. Lên men đường saccarose tốt hơn lên men đường lactose.
- Lactobacterium lycopersici: là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo thành chuỗi hay đơn, có khi ghép thành đôi một. Khi lên men chúng tạo thành axit lactic, rượu êtylic, axit axetic và CO2. Chúng có khả năng tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng thường chết ở nhiệt độ 800C.
1.3.2. Giới thiệu về giống Lactobacillus
Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, kích thước lớn (0,5 - 0,7 × 2 - 8 μm), đại bộ phận các loài không di động, không sinh bào tử, có dạng hình que hay hình cầu. Chúng có những nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp và làm lên men hoàn toàn, hiếu khí
30 – 350 C. Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng hay đục sữa.
Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất axit lactic là một sản phẩm phụ
của quá trình chuyển hóa glucose.
-Lactobacillus được tìm thấy trong các môi trường sống có chứa nhiều cacbohydrat và phân bố rộng khắp trong thức ăn, thức ăn ủ chua, phân bón, sữa và các sản phẩm sữa và trong đường ruột người, động vật, thủy sản….
-Nhiều loài Lactobacillus được sử dụng thương mại trong việc sản xuất các loại sữa chua, pho mát và sữa chua, và họ có một vai trò quan trọng trong sản xuất rau quả
lên men (dưa chua và dưa cải bắp), đồ uống (rượu vang và nước trái cây), bánh mì bột chua, và một số xúc xích . Ngày nay Lactobacillus được sử dụng trong chế phẩm probiotic cho cả con người và vật nuôi. Đặc biệt, trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản chế
phẩm probiotic đang được phát triển và ứng dụng ngày càng rộng rãi.
1.3.2.1 Giống Lactobacillus – các đặc tính của vi khuẩn probiotic
1.3.2.2.1 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh bệnh
Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với nhiều vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và kể cả nấm.Lactobacillus có khẳ năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao gồm: các axit hữu cơ (axit lactic và axetic axit), hydrogen peroxit, cacbondioxit, và diaxetyl cũng như bacterioxin và các hợp chất giống bacterioxin ( Mishra và Lambert, 1996; Ouwehand và cộng sự, 1999). Cả axit lactic và axit axetic
đều có khẳ năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính điều này đã ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác (Mishra và Lambert, 1996). Hydrogen peroxit ức chếđược sự phát triển của cả vi khuẩn Gram(+) và Gram(-) (Hollang, Knapp, và Shoesmith, 1987; Mishra và Lambert, 1996). Diacetyl tác động ức chế lên sự tăng trưởng bằng cách can thiệp sử dụng arginine (Jay, 1986)
của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacterioxin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh như: E.coli; Samonella; Vibrio; Campylobacter, Shigella, Vibrio, Clostridium, Candida albicans, và một số virus khác nữa (O’Sullivan và Kullen, 1998).
1.3.2.2.3 Khả năng chịu mặn
Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển. Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho NTTS ở các vùng khác nhau.
Một số chủng Lactobacillus đã được biết với khả năng chịu độ mặn cao, cao hơn rất nhiều so với độ mặn trung bình từ 3,1‰ tới 3,8‰ của nước biển như:
- L. amylovorus DCE 471có thể tồn tại và sinh ra bacterioxin trong môi trường 3 % (w/v) NaCl (Patricia Neysens và cộng sự, 2003)
- Lactobacillus sakei có thể sống trong môi trường có độ mặn rất cao 9% NaCl
(Chaillou và cộng sự, 2005).
1.3.2.2.4 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa
Trong các điều kiện invitro, nhiều chủng Lactobacillus đã được tuyển chọn với khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đường ruột động vật thủy sản như môi trường axit HCl ở dạ dày, môi trường kiềm của ruột, lyzozyme, dịch tụy, dịch mật. (Srikanjana Klayraungvà cộng sự, 2008 ). Khả năng tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa giúp cho các vi sinh vật probiotic có thể cạnh tranh được vị
trí bám dính và các nguồn dinh dưỡng, năng lượng với các vi khuẩn gây hại.
Một số chủng Lactobacillus có khả năng tồn tại tốt trong đường tiêu hóa đã
được phân lập như: L. curvatus, L. reuteri, L.plantarum, L. parapentarum, L. pentosus,
L. keferi, L. fermentum, L. animalis, L.mucosae, L. aviaries ssp. aviaries, L.salivarius
1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn lactic nói chung và
Lactobacillus nói riêng.
1.3.2.1.1. Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần
đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn
ảnh hưởng không nhỏđến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.
•Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Cacbon là thành tố chính trong các hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể của mọi loài sinh vật. Vì vậy sự chuyển hoá nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật.
Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose (glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho
đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin).
+ Glucose ở dạng D- glucose, là loại monosaccarit hấp thụ dễ dàng nhất. Chúng
được vi sinh vật sử dụng đầu tiên rồi mới đến các loại khó chuyển hoá hơn. Vì vậy trong quá trình sản xuất người ta thường đưa về loại đường này cho vi sinh vật dễ sử
dụng.
+ Lactose là disaccarit, nó là đường có trong sữa người và động vật. Một số
chủng vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng lactose làm thức ăn vì chúng có khả năng sinh enzym β-galactosidase. Enzym này thuỷ phân lactose thành glucose và galactose, giúp cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn được dễ dàng hơn.
+ Sucrose cũng là một disaccarit. Trong quá trình lên men dưới tác dụng của enzym sucrose hydrolase bị thuỷ phân thành glucose và fructose. Vài loài lactococci, saccarose được vận chuyển bởi hệ enzym sucrose phosphotransferase và một enzym
đặc hiệu sucrose-6-phosphate hydrolase phân cắt sucrose-6-phosphate thành glucose-6- phosphate và fructose. Những enzym này chỉ được tiết ra khi xuất hiện sucrose trong môi trường (Thompson và Chassy, 1981).
+ Maltodextrin là sản phẩm trung gian khi thuỷ phân tinh bột thành đường, có 3- 20 chuỗi. Những chuỗi này được tạo bởi vài gốc dextroza liên kết với nhau bởi liên kết hidro yếu.
Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccrit và disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic… Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm thực phẩm, có thể sử dụng các axit gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axit axetic và axit lactic. Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng. Khi đó tạo ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO2. Các loại vi khuẩn khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Một số loài vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột (William và Wilkins, 1986). Sự phát triển của vi khuẩn lactic với mỗi loại
đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các quá trình xử
lý sau này. Nhóm các nhà khoa học của Carcalho đã khẳng định rằng khả năng sống sót của L. bulgaricus trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ
sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men từ manose thì tỷ lệ tế
bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructose và lactose (Carvalho và cộng sư, 2004). Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đến vấn đề kinh tế
nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào.
•Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của tất cả sinh vật. Vật chất cơ
quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều axit amin khác nhau do đó chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ nhằm
đảm bảo sự phát triển của mình. Axit amin có thể được đồng hoá dưới dạng peptit nhờ
vào tác dụng của enzym protease ngoại bào hay nội bào.
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ
nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ như L. helveticus, chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường (Chopin, 1993).
Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ
phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thuỷ phân, dịch chiết thịt, trypton…Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị
môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao được hiệu quả
sản xuất. Trong đó dịch nấm men thuỷ phân được sử dụng khá nhiều (Lars Axelsson, 2004).
•Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng
Các muối vô cơ và các chất khoáng chỉ với lượng rất nhỏ nhưng lại có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chẳng hạn đối với
Lactobacillus Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic, hay