Phân lập, tuyển chọn và đánh giá một số đặc tính của một số chủng lactobacillus trên cá chim vây vàng

Mục tiêu của đề tài là phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio để bổ sung vào chế phẩm probiotic nuôi cá chim vây vàng nhằm mục đích tăng tốc độ tăng trưởng, khả

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

Khoá : 49

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

Khoá : 49

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Lê Đình Đức, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp 49SH, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi

Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua

Nha Trang, tháng 6 năm 2011

Lê Thanh Huân

1.1.1 Giới thiệu vê Probiotics 3

1.1.2 Cơ chế tác động của probiotic 5

1.1.2.1 Sản sinh ra các chất ức chế 5

1.1.2.2 Cạnh tranh cơ chất, năng lượng với những vi khuẩn khác 5

1.1.2.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh 6

1.1.2.4 Tăng cường đáp ứng miễn dịch 6

1.1.2.5 Cải thiện chất lượng nước 7

1.1.3 Ứng dụng của probiotic 7

1.1.3.1 Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong y học, trong trồng trọt, trong bảo vệ môi trường 7

1.1.3.2 Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 8

1.1.4 Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics 11

1.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới và trong nước 15

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới 15

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng ở Việt Nam 16

1.2.3 Tình hình bệnh dịch trên cá nuôi nước mặn nói chung và cá chim vây vàng nói riêng 17

1.3.1.1 Giới thiệu chung 20

1.3.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic 22

1.3.1.2.1 Lên men đồng hình 22

1.3.1.2.1 Lên men dị hình 23

1.3.2 Giới thiệu về giống Lactobacillus 23

1.3.2.1 Giống Lactobacillus – các đặc tính của vi khuẩn probiotic 24

1.3.2.2.1 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh 24

1.3.2.2.3 Khả năng chịu mặn 25

1.3.2.2.4 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa 25

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn lactic nói chung và Lactobacillus nói riêng 26

1.3.2.1.1 Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng 26

13.2.2.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy 29

1.3.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản 30

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.1 Mẫu cá 33

2.1.2 Môi trường nghiên cứu 33

2 2 Nội dung nghiên cứu 35

Hình 2.1:Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 35

2 3 Phương pháp nghiên cứu 36

2.3.1 Phương pháp phân lập, tuyển chọn 36

2.3.1.1 Phân lập Lactobacillus 36

2.3.1.2 Nuôi cấy và bảo quản các chủng Lactobacillus 36

2.3.1.3 Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio 37

2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa 38

2.3.2.1 Quan sát đặc điểm hình thái 38

2.3.2.1.1 Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi 38

2.3.2.1.2 Nhuộm Gram 38

2.3.2.2 Quan sát đặc tính sinh hóa 39

2.3.2.2.1 Khả năng sinh acid lactic 39

2.3.2.2.2 Phản ứng catalase 40

2.3.2.2.3 Khả năng di động 40

2.3.2.2.4 Khả năng sử dụng các loại đường: 41

2.3.3 Xác định các điều kiện nuôi cấy 41

2.3.3.1 Xác định khả năng sinh trưởng 41

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Kết quả phân lập tuyển chọn 44

3.1.1 Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng 44

3.1.2 Kết quả tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio 44

3.2 Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa 46

3.2.1 Đặc điểm hình thái 46

3.2.1.1 Đặc điểm hình thái của chủng L1.2 46

3.2.1.2 Đặc điểm hình thái của chủng L1.3 48

3.2.2 Đặc điểm sinh hóa 51

3.3 Đặc tính nuôi cấy và đặc tính probiotic 52

3.3.1 Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3 52

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3 54

3.3.3 Thời gian nuôi cấy 55

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 : Cá chim vây vàng 14

Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1, C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37oC 45

Hình 3.2: Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC 46

Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C 47

Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X 47

Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram của chủng L1.2 48

Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C 49

Hình 3.7: Hình thái tế bào của chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X 49

Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 50

Hình 3.9: Khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3 51

Hình 3.10: Khả năng lên men các loại đường của chủng L1.2 và L1.3 51

Hình 3.11: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 nm của chủng L1.2 53

Hình 3.12: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 của chủng L1.3 53

Hình 3.13 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 55

Hình 3.14: Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào sống của hai chủng L1.2 và L1.3 ở OD600 nm 56

Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 57

Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3 58

KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nghành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triển nhanh chóng Theo công bố của FAO năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản của Việt Nam là 1,67 triệu tấn, xếp vị trí thứ 6 Châu Á Hiện nay đối tượng nuôi trồng

chủ yếu là các loài thủy hải sản nước mặn như: cá mú (Epinephelus spp), cá giò (Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcariper), cá cam (Seriola spp), cá hồng (Lutijanus erythropterus), cá chim (Trachinotus blochii), ốc hương (Babylonia

areolata), vẹm xanh (Perna viridis), tôm sú (Penaeus monodon), trong đó đối tượng

nuôi mới là cá chim vây vàng đang được chú ý phát triển nuôi bởi vì thịt cá thơm ngon hấp dẫn, hàm lượng dinh dưỡng cao, rất được ưa chuộng

Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) là loài phân bố tương đối rộng ở vùng biển nhiệt đới, Tây Thái Bình Dương, Nhật Bản, Đài Loan, Indonesia, miền Nam Trung Quốc Nước ta cá phân bố chủ yếu ở vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ Cá có kích cỡ thương mại 0,8 -1 kg/con, giá trị kinh tế cao với giá bán 100.000 VNĐ/kg, thị trường xuất khẩu: Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc, Hồng Kông, Mỹ, Singapore Đây là một đối tượng nuôi mới ở Việt Nam, chưa được nghiên cứu nhiều nên người nuôi vẫn gặp khó khăn do tỷ lệ cá chết cao, sức chống chọi trước các điều kiện bất lợi của môi trường và các vi khuẩn gây bệnh còn thấp đặc biệt là các bệnh do Vibrio gây ra

Để khắc phục tình trạng này, người nuôi đã dùng các loại hóa chất khử trùng, các chất kháng sinh phòng bệnh Tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp này không cao, ngược lại còn gây ảnh hưởng đến môi trường, nguy hiểm hơn nếu lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây ra tồn dư kháng sinh và hiện tượng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản Vì vậy, việc tìm ra một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng

Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính: đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, sinh các enzyme tiêu hóa, phân hủy các chất hữu cơ thừa …đã được áp dụng Các chế phẩm sinh học không những tăng

khả năng sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho vật nuôi mà còn hạn chế được tối đa khả năng sử dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh thủy sản Nhiều nhóm vi sinh vật mang các đặc tính probioic đã được áp dụng, trong đó có nhóm vi khuẩn

Lactobacillus

Với lí do như vậy nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển

chọn và đánh giá tiềm năng probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập trên

Các nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Phân lập các chủng Lactobacillus và Vibrio trong ruột cá chim vây vàng - Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính khảng Vibrio

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Lactobacillus

- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hơp cho các chủng Lactobacillus.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về probiotic

1.1.1 Giới thiệu vê Probiotics

Theo Tổ chức nông nghiệp và lương thực của Liên hợp quốc (FAO) “Probiotic

là những vi sinh vật sống, nếu được bổ sung với liều lượng hợp lý sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ”

Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhưng tác dụng của nó đã được nhận thấy từ lâu Elie Metnhicoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908) Năm 1908, ông đề nghị sử

dụng vi khuẩn lactic (Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài tuổi thọ

con người

Ngày nay chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả để phòng bệnh cho người và vật nuôi Chế phẩm probiotic đang được sử dụng như một loại thuốc để phòng và điều trị bệnh cho người và vật nuôi Các nghiên cứu cho thấy chế phẩm này mang lại nhiều lợi ích cho đường ruột như: cân bằng hệ vi sinh vật khu trú trong đường ruột, kích thích tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch và phòng ngừa nhiễm trùng cho cơ thể Ngoài ra, chế phẩm probiotic sử dụng trong y học còn có khả năng giảm viêm, giảm cholesteron, tăng quá trình hấp thu khoáng, ngăn ngừa sự phát triển vi khuẩn gây bệnh viêm ruột, điều hoà trường hợp không dung nạp lactose và đề phòng được ung thư kết tràng… Một số chủng vi sinh vật đã được sử dụng trong chế phẩm probiotic

cho người như: Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus

johnsonii, Bacillus subtilis…

Nhiều chủng vi khuẩn cũng được sử dụng để sản xuất ra các chế phẩm ứng dụng

rất hiệu quả nhằm kiểm soát côn trùng gây hại cho cây trồng như vi khuẩn Bacillus

thuringiensis, nấm Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae, virus NPV.v.v

Ngoài ra các chế phẩm vi sinh còn được sử dụng để làm phân bón vi sinh nhằm phân giải các chất hữu cơ làm giàu cho đất, phân giải lân khó tiêu thành lân dễ tiêu để cây

trồng hấp thu được Các chế phẩm vi sinh sử dụng trong các hệ thống xử lý rác thải và nước thải, làm sạch dầu mỏ trong các vụ tràn dầu

Mặc dù vậy, việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) vẫn còn khá mới mẻ, mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây Đối với mỗi loài thủy sản khác nhau cần có chế phẩm probiotic với những chủng vi sinh vật thích hợp riêng Phương thức sử dụng chủ yếu là bổ sung trực tiếp vào thức ăn hoặc thêm vào môi trường nước nuôi Nhiều nhà nghiên cứu trong lĩnh vực này đều nhận thấy chế phẩm Probiotic đã tạo ra những thay đổi đáng kể về khu hệ vi sinh trong đường ruột theo hướng cân bằng có lợi trong đó các vi khuẩn có ích tăng đáng kể, số

lượng các vi sinh vật có khả năng gây bệnh như E.coli, Samomella, Listeria…giảm

mạnh Những phát hiện mới về khả năng tăng cường miễn dịch, điều chỉnh những sai lệch bất lợi ở hệ vi sinh vật đường ruột do bênh nhiễm khuẩn, virus, dị ứng thức ăn đang mở ra triển vọng áp dụng chế phẩm này trong nuôi trồng thủy sản, cân bằng sinh thái và bảo vệ môi trường

* Thành phần chế phẩm probiotic

Vi sinh vật trong chế phẩm Probiotic thường gồm 4 nhóm sau:

- Nhóm vi khuẩn lactic: Thường chọn các chủng vi khuẩn lactic điển hình

thuộc giống Lactobacillus (Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus casei …) Trong hoạt động sống vi khuẩn lactic chuyển đường thành

axit lactic, ngoài ra nó có thể sinh ra Baterioxin – một loại hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng Loại chất kháng sinh này không gây ra tính kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây bệnh Axit lactic và Bacterioxin có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, giải độc cho đường ruột

- Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: Chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính α amylase và protease Các chủng này không gây độc, gây bệnh cho người và vật nuôi Nhóm vi khuẩn này có tác dụng phân giải các hợp chất hữu cơ bị ô nhiễm

trong môi trường Thường chọn các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus (Bacillus

subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus lichenifomis,… ) Ngoài khả năng sinh α

amylase và protease chúng còn sinh ra Bacterioxin Các vi khuẩn này chủ yếu tham gia vào quá trình làm sạch môi trường và tham gia vào quá trình đấu tranh sinh học, ức chế vi khuẩn gây bệnh, hạn chế dịch bệnh cho vật nuôi

- Nhóm vi khuẩn quang tự dưỡng ( Photoautotrop): Gồm các vi khuẩn tía và vi khuẩn không tía có khả năng đồng hóa H2S và CO2 để xây dựng tế bào và không sinh ra O2 Trong khi phân hủy H2S hoặc muối sulfua kim loại gây ra, làm giảm tính độc cho môi trường Khi cho thêm vi khuẩn quang tự dưỡng vào thức ăn hoặc môi trường nước nuôi có thể loại bỏ nhanh chóng NH3, H2S, axit hữu cơ, những chất có hại, cân bằng pH, cải thiện chất lượng nước

- Nhóm nấm men: Gồm một số loài thuộc giống Sacaromyces, sử dụng nấm

men sẽ có tác dụng tận dụng lượng đường được tạo thành trong môi trường nước để lên men rượu nhẹ, hạn chế dinh dưỡng của các loại vi sinh vật gây bệnh khác, cải thiện mùi và màu của nước

1.1.2 Cơ chế tác động của probiotic

1.1.2.1 Sản sinh ra các chất ức chế

Các vi khuẩn probiotic sinh các chất ức chế: bacteriocin, siderophores, lysozym, protease, H2O2, các axit hữu cơ, amoni, diaxetyl…các chất này được sinh ra bên trong đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hại khác (Saurabh S, Choudhary AK và Sushma GS, 2005).Ví dụ:

Lactobacillus sp sản sinh ra bacteriocin là chất ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn gây

bệnh Alteromonas sp dòng B-10-31 sản sinh monostatin làm ức chế hoạt tính protease của Aermonas hydrophyla và Vibrio anguillarum

1.1.2.2 Cạnh tranh cơ chất, năng lượng với những vi khuẩn khác

Cạnh tranh dinh dưỡng của các vi sinh vật probiotic có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật bên trong đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi Probiotic có khả năng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng đối với các vi khuẩn lây bệnh và sẽ hạn chế được sự phát triển, lây lan của các chủng vi sinh vật đó Vi

khuẩn có hại bị loại bỏ có nghĩa là loại bỏ được đối thủ cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng dùng cho vi khuẩn probiotic và cho vật chủ

Ví dụ: sự hấp thụ các monosaccarit của các vi sinh vật probiotic có thể làm giảm

sự phát triển của Clostridium difficile gây ra bệnh tiêu chảy trên vật nuôi bởi vì sự phát triển của Clostridium difficile phụ thuộc vào các monosaccarit (Kenneth, H.Wilson và

Fulvio Periniz, 1998) Ngoài ra các vi khuẩn sinh siderophore được sử dụng làm probiotic để cạnh tranh Fe với các vi khuẩn gây hại Vì siderophore là chất có khối lượng phân tử thấp, nó có khả năng gắn với các ion Fe Siderophore có thể hoà tan Fe kết tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật, do đó nó là công cụ thu lượm Fe trong môi trường

1.1.2.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh

Cạnh tranh vị trí bám dính trên đường ruột là một tiêu chí quan trọng để dánh giá hiệu quả của vi sinh vật probiotic (Ringo E và Gatesoupe FJ, 1998) Vi khuẩn probiotic cạnh tranh vị trí bám dính trên thành ruột hay trên các biểu mô khác có vai trò ngăn cản sự khu trú và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Người ta đã chứng

minh khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt ruột của Lactobacillus GG và

Lactobacillus plantarum 299V để ngăn cản sự phát triển và lây lan của vi khuẩn Escherichia coli 0157H7 gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật nuôi (Mack DR,

Michail S, Wei S, Macdougal L, Hollingsworth MA, 1999) Ngoài ra một số vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus cũng được biết có thể khóa chặt các thụ thể bề mặt trong đường ruột để hạn chế được sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh khác (Bernet MF, Brassart D, Neeser JR, Servin AL, 1994 )

1.1.2.4 Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Chế phẩm probiotic có tác động tích cực lên hệ thống miễn dịch của cơ thể Nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn trong chế phẩm probiotic có khả năng tăng cường quá trình sản xuất các kháng thể và giải phóng cytokin gây ra đáp ứng miễn dịch cho cơ thể (Jon A Vanderhoof, M.D., Series Editor, 2005) Probiotic còn tác động lên

các tế bào tua, từ đó cảm ứng tế bào limpho T để dung nạp/điều hòa và kích thích các đáp ứng miễn dịch Ngoài ra, kháng nguyên của vi khuẩn probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh, các chhất ức chế của probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả kháng thể của vật chủ

Người ta thấy rằng bổ sung vi khuẩn lactic làm tăng khả năng chống lại bệnh truyền nhiễm đường ruột Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy probiotic có ảnh hưởng quan trọng đối với các đáp ứng miễn dịch thích ứng ở những bệnh như dị ứng sữa bò ở trẻ em, viêm khớp tự miễn ở người lớn

1.1.2.5 Cải thiện chất lượng nước

Chế phẩm probiotic giúp giảm nồng độ các chất hữu cơ trong nước, giảm hàm lượng BOD, giảm độc do amoni, nitrat và khí hydrosunfua, khống chế được vi khuẩn gây bệnh Các vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có thể cải thiện chất lượng nước bởi chúng có thể sử dụng các chất hữu cơ dư thừa hoặc các chất khí như H2S để làm

chất dinh dưỡng thông qua các enzyme ngoại bào (Prieur và cộng sự,1990)

- Trong trồng trọt: Chế phẩm probiotic có tác dụng với nhiều loại cây trồng (bao gồm cây lương thực, cây ăn quả, cây hoa màu…) và ở mọi giai đoạn sinh trưởng phát

triển khác nhau (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2004) Những nghiên cứu về tác dụng của

probiotic với cây trồng cho thấy chúng có thể:

+ kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả và quá trình chín của quả, + cải thiện hệ vi sinh vật đất, ngăn chặn các mầm bệnh,

+ tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng và kéo dài được thời gian bảo quản, tăng chất lượng các sản phẩm tươi sống, làm cho hoa trái tươi lâu

Dùng chế phẩm probiotic trong đất có thể tái lập quần thể hệ vi sinh vật mới có lợi cho cây trồng, đặc biệt là hệ vi sinh vật vùng rễ Cây trồng sẽ phát triển tốt ở đất, nơi mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nâng cao được hiệu suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ (Võ Thị Hạnh

và cộng sự, 2005)

- Trong bảo vệ môi trường: Do có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây thối (sinh ra các loại khí H2S, SO2, NH3…) nên khi phun chế phẩm probiotic vào rác thải, cống rãnh, chuồng trại chăn nuôi…sẽ khử mùi hôi một cách nhanh chóng Đồng thời số lượng ruồi, muỗi, ve, các loại côn trùng bay khác giảm hẳn số lượng Rác hữu cơ được xử lý EM chỉ sau một ngày có thể hết mùi và tốc độ mùn hoá diễn ra rất nhanh Trong các kho bảo quản nông sản, sử dụng EM có tác dụng ngăn chặn được quá trình gây thối, mốc Các nghiên cứu cho biết chế phẩm EM có thể giúp cho hệ vi sinh vật tiết ra các enzym phân huỷ như lignin peroxidase, enzyme amylase, protease, cellulase và đặc biệt là cellulase, hemicellulase Các enzym này có khả năng phân huỷ các hoá chất nông nghiệp tồn dư, thậm chí cả dioxin Ở Belarus, việc sử dụng EM liên tục có thể loại trừ ô nhiễm phóng xạ (Teruo Higa, 2002)

1.1.3.2 Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Mặc dù chế phẩm probiotic mới được ứng dụng vào nuôi trồng thủy sản trong thời gian 10 năm trở lại đây nhưng hiệu quả của chế phẩm này là rất to lớn Hiện nay

các loài vi sinh vật: Bacillus, Lactobacilus, nhóm vi khuẩn quang dưỡng… được sử

dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm này Những nghiên cứu cho thấy rằng các loài vi khuẩn này đều không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước

Cải thiện môi trường nước nuôi:

Chế phẩm probiotic được bổ sung vào môi trường nước nuôi thủy sản có tác dụng cải thiện chất lượng nước

Trong nuôi trồng thủy sản, lượng thức ăn dư thừa do động vật thủy sản hấp thụ không hết chiếm số lượng rất lớn, đây là nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường nước Đặc biêt trong nuôi tôm, tôm chỉ hấp thụ được dưới 1/3 tổng lượng dinh dưỡng đầu tư vào ao nuôi (Briggs và Funge-Smith, 1994) và phần còn lại bị mất vào hệ thống ao nuôi (Wu, 1995 và Piedrahita, 2003) Hơn nữa, các chất bài tiết từ các loài thủy sinh vào môi trường nước chiếm khoảng 70 – 80% lượng protein chúng đã tiêu hóa, phần lớn trong số đó (80%) ở dưới dạng dễ hòa tan trong nước, đặc biệt là ammoniac (Porter

và cộng sự, 1987) Các chất thải này, bao gồm thức ăn dư thừa và các sản phẩm bài

tiết, có thể phì nhưỡng cho ao nuôi và kết quả là sự phát triển bùng nổ của tảo độc cũng như gây ra hiện tượng thiếu ô-xy trong nước Chế phẩm probiotic được bổ sung vào môi trường nước có chưa các vi khuẩn có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào như protease, amylase có thể phân giải các chất hữu cơ và các chất bài tiết thành CO2 và nước, chuyển các chất độc hại như NH3, H2S, NO2 - thành các chất không độc như NO3-, NH4+, giúp giảm mùi hôi của môi trường nước, ổn định pH và màu nước ao (Võ

Thị Hạnh và cộng sự, 2005) Các chủng vi sinh thường được sử dụng để thực hiện chức năng này gồm Bacillus sp, Nitrosomonas, Nitrobacter như vậy các vi khuẩn trong chế

phẩm probiotic co tác dụng

- Làm ổn định chất lượng nước và nền đáy trong ao nuôi tôm cá

- Giảm thiểu ô nhiễm môi trường ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên

Nhiều loại chế phẩm vi sinh được sử dụng để cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản như: chế phẩm EM, BIOnAQUA 1-MV( công ty Mai Việt), BZT® Aquaculture (USA), BIO II (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2005).…

Tăng tốc độ sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho đối tượng nuôi:

Nghề nuôi trồng thủy sản đang đối mặt với các loại bệnh dịch, nguyên nhân chủ

yếu là do các loại vi khuẩn Aeromonas.sp, Pseodomonas.sp, Vibrio sp. Tuy nhiên , chúng ta hạn chế sử dụng kháng sinh để phòng bênh nên chế phẩm probiotic có vai trò vô cùng quan trọng Hiện nay trong nuôi trồng thủy sản cũng phân lập được nhiều loại

probiotic như Carnobacterium piscicola (Hius, 1984), Lactobacillus plantarum (Schroder, 1984), Pediococcus acidilactici (Pucci, 1988 ) Các chủng vi sinh vật có thể

cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng bên trong đường ruột nhờ khả năng chịu mặn, chịu kiềm, chịu axit của đường ruột Bên cạnh đó, các chủng probiotic này càng được chú ý hơn nhờ khả năng sinh ra các chất ức chế (bacteriocins, sideropheres, lysozymes, hydrogen peroxides ) và tổng hợp được các hợp chất kháng sinh tương ứng như: piscicolin, plantarin, pediococin (PA - 1) có tính sát khuẩn cao, đặc biệt đối với vi

khuẩn gây bệnh như: Listeria monocytogenes (Pucci, 1988), Shigella spp và

Salmonella spp… Vì vậy khi bổ sung chế phẩm probiotic có chứa các vi sinh vật này

vào thức ăn sẽ kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh, đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột tôm cá, giúp đối tượng nuôi tăng trưởng và phát triển tốt, chống chọi được với các loại bênh dịch Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng

nuôi đây là biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong và cộng

sự, 1998)

Bên cạnh đó chế phẩm probiotic sẽ giúp tôm cá sinh trưởng mạnh hơn do các vi khuẩn trong chế phẩm probiotic chính là nguồn cung cấp các enzyme tiêu hóa, một số vitamin và axit béo có tác động tích cực đến quá trình chuyển hóa của cá tôm (Sakata,

1990) Nhờ đó tôm cá sẽ hấp thụ thức ăn tốt hơn, có sức chống chịu với các điều kiện môi trường, tăng sức đề kháng

Ngoài ra, chế phẩm probiotic còn được biết với khả năng kháng virus Một số nghiên cứu cho thấy các chủng vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có khả năng kháng một số tác nhân virus gây bệnh trên động vật thủy sản, trong đó khả năng kháng virus

gây bệnh trên trên tôm sú như IHNV (Kamei và cộng sự, 1988) và OMV (Direkbusarakom và cộng sự, 1998) Như vậy, chế phẩm probiotic còn có thể giúp cho

nuôi trồng thủy sản chống chọi với tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất là virus Đây có thể là một ưu thế lớn cho việc sử dụng chế phẩm probiotic vào nuôi trồng thủy sản trong tương lại

1.1.4 Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics

Quy trình tạo chế phẩm probiotic :

Chủng giống Nguyên liệu

Nhân giống

Lên men

Sinh khối

Chế phẩm dạng dịch Chất phụ gia

Chế phẩm dạng bột

1.1.4.1 Nguyên liệu

Môi trường dùng để nuôi thu sinh khối vi khuẩn cần đảm bảo đủ thành phần chất dinh dưỡng, khoáng, chất kích thích sinh trưởng, VTM Và một yêu cầu đối với nguyên liệu dùng để sản xuất công nghiệp là nguyên liệu phải rẻ tiền, dễ kiếm

Đối với chủng giống vi sinh vật, cần lựa chọn những chủng có đầy đủ các đặc tính mà ta cần để sản xuất chế phẩm mà ta mong muốn

1.1.4.2 Nhân giống

Chủng giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC Vì vậy, khi sử dụng ta cần hoạt hóa giống, bằng cách cấy chuyền sang ống thạch nghiêng, đặt trong tủ ấm 320 sau 24-48h

• Nhân giống cấp1: Chủng sau khi phát triển tốt trong ống thạch nghiêng được

cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường MRS, LB, EB đối với các chủng vi khuẩn lactic, bacillus, vi khuẩn quang dưỡng Nuôi ở 370C trong 24h

• Nhân giống cấp 2: Các chủng giống cấp 1 đã phát triển tốt được cấy chuyền

sang môi trường lỏng với tỷ lệ 10% giống, trong bình tam giác Nuôi ở 370C trong 24h

• Nhân giống cấp 3: Giống cấp 2 được nhân tiếp sang thùng nhựa có thể tích lớn

hơn với tỷ lệ giống 10%, nuôi ở 370C Giống cấp 3 được dùng để lên men trong những thùng lên men lớn để thu sinh khối

1.1.4.3 Thu sinh khối

Sau lên men, dịch lên men được xử lý để thu sinh khối Có các phương pháp thu sinh khối như:

- Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút, nhiệt độ 40C trong 10 phút Phương pháp này chỉ được áp dụng trong phòng thí nghiệm

- Dùng màng siêu lọc Những màng này có thể lọc được vi khuẩn Hiện nay phương pháp này được áp dụng nhiều trong công nghiệp

1.1.4.4 Tạo chế phẩm

Dịch sinh khối sau khi đã xử lý được trộn với chất mang Chất mang giúp vi khuẩn có thể tồn tại lâu, nó như chất bảo quản chế phẩm Chất mang thường là khô đậu tương, khô lạc, cám gạo, bột gạo, đường lactose, sucrose…

Sau khi trộn chất mang ta tiến hành sấy khô chế phẩm đến độ ẩm 8-12% để bảo quản Có thể dùng các phương pháp sấy:

• Sấy hút chân không

+ Nguyên lý làm việc: Dưới môi trường áp suất chân không, các khay chứa nguyên liệu được quay đảo bên trong buồng sấy nhằm tăng hiệu suất sóng cao tần Hàm ẩm trong nguyên liệu được gia nhiệt nhanh và bay hơi thoát ra ngoài bề mặt tăng tốc độ sấy so với kiểu gia nhiệt truyền dẫn

+ Ưu điểm: Hiệu suất sấy cao, tiêu hao năng lượng ít, nhiệt độ sấy thấp nên thích hợp với sản phẩm nhạy nhiệt

+ Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền

• Sấy chân không thăng hoa

+ Ưu điểm: Nhiệt độ sấy thấp nên bảo toàn được giá trị của sản phẩm + Nhược điểm: Chi phí cho thiết bị và năng lượng cao

1.1 Tổng quan về cá chim vây vàng

1.2.1 Giới thiệu chung về cá chim vây vàng

Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepède 1801) phân bố ở miền Nam

Nhật Bản, Tây Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương, Đại Tây Dương Vùng biển nhiệt đới và Á nhiệt đới, vùng biển Đông Nam Á và vùng biển Tây Châu Phi Ở Trung Quốc chúng phân bố vùng biển Đông Hải, Nam Hải, Hoàng Hải, vùng biển Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, Phúc Kiến Cá chim vây vàng cũng đã tìm thấy ở vùng biển nước ta Ở Việt Nam, cá chim vây vàng được tìm thấy trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ

Hình 1.1 : Cá chim vây vàng

Cá chim vây vàng có cơ thể hơi tròn và bề bên dẹp chính giữa lưng hình vòng cung, bề mặt da có màu trắng xám và vây lưng có màu ánh bạc vàng Cá chim vây vàng có kích thước tương đối lớn, kích thước có thể đạt 45 - 60 cm Cá sinh trưởng nhanh, trong điều kiện nuôi bình thường 1 năm đạt 0,5 - 1 kg/con Từ năm thứ 2 trở đi mỗi năm khối lượng tăng tuyệt đối là 1 kg

Cá chim vây vàng là loài cá nước ấm, có tập tính di cư, sống ở tầng giữa và tầng mặt Ở giai đoạn cá giống hàng năm sau mùa đông cá thường tập trung thành đàn sống ở vùng vịnh, cửa sông Cá trưởng thành sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 22 – 280C, là loài rộng muối 3 - 33 ppt Dưới 20 ppt cá sinh trưởng nhanh, trong điều kiện độ mặn cao tốc độ sinh trưởng chậm lại Nhu cầu hàm lượng oxy hòa tan lớn hơn 2,5 mg/L

Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trưởng thành có thể bắt những động vật vỏ cứng như: ngao, cua, ốc Giai đoạn cá giống thức ăn là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia Cá con ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ Thức ăn chính của cá trưởng thành là các loại tôm cá nhỏ Cá trưởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn toàn thức ăn công nghiệp trong nuôi thương phẩm.

Cá Chim vây vàng (Trachinotus bloochi) có thịt thơm ngon, có khả năng chống

chịu dịch bệnh tốt Cá chim vây vàng là loài cá biển có giá trị kinh tế cao, được nuôi nhiều ở vùng biển miền Nam Trung Quốc và một số quốc gia trên thế giới, cá đang được tiêu thụ mạnh ở Nhật Bản, Đài Loan, Hồng Kông, Trung Quốc, Mỹ, Singapore Nước ta có vùng biển ấm, nhiềuvùng vịnh, đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió Bên cạnh đó, là chất lượng nước tốt, độ mặn nước biển tương đối ổn định Đây là điều kiện vô cùng thuận lợi để phát triển nghề nuôi cá chim vây vàng ở Việt Nam

1.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới và trong nước 1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới

Năm 1986, ở Đài Loan, Lâm Liệt Đường đã thu gom 126 con cá chim vây vàng loại nhỏ, loại vừa và lớn nuôi chung với nhau Năm 1989, Lâm Liệt Đường lần đầu tiên sinh sản nhân tạo cá chim vây vàng thành công Năm 1991, Lâm Liệt Đường tăng thêm đàn bố mẹ cho tiến hành sinh sản nhân tạo

Năm 1993, Trung tâm chuyển giao công nghệ Trường Đại học Trung Sơn kết hợp với Trại Nghiên cứu giống Thủy sản Quảng Đông – Trung Quốc nghiên cứu sinh sản nhân tạo thành công giống cá chim vây vàng quy mô nhỏ (ương nuôi ấu trùng

trong bể xi măng) Năm 1998, Trung tâm đã kết hợp với Công ty trách nhiệm hữu hạn giống thủy sản Thắng Lợi – Hải Nam – Trung Quốc nghiên cứu sản xuất nhân tạo thành công trên quy mô lớn (ương nuôi ấu trùng trong ao đất)

Bên cạnh đó, Trung tâm phát triển nuôi biển ở Batam – Indonesia (Nur Muflich Juniyanto, Syamsul Akbat và Zakimi) đã thành công trong việc sản xuất giống nhân tạo cá chim vây vàng, vì vậy con giống có thể được sản xuất ở địa phương vượt mức và làm giảm áp lực khai thác giống ngoài tự nhiên

Cá chim vây vàng đã và đang được nuôi nhiều ở vùng biển miền Nam Trung Quốc và một số quốc gia trên thế giới, cá đang được tiêu thụ mạnh ở Nhật Bản, Đài Loan, Hồng Kông, Trung Quốc, Mỹ, Singapore

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng ở Việt Nam

Năm 2006, Trung tâm Khuyến nông Quốc gia đã phối hợp với Trường Cao đẳng Thủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I thực hiện dự án nhập công nghệ sản xuất nhân tạo cá chim vây vàng do Trung tâm chuyển giao công nghệ Trường Đại học Trung Sơn Trung Quốc chuyển giao

Năm 2009 Khoa Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang bắt đầu thử nghiệm cho đẻ nhân tạo cá chim vây vàng tại Bè Nghiên cứu Thực nghiệm - Khoa Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa, sau đó ấp trứng và ương giống thành công tại Trại Sản xuất Giống cá Biển – Khoa Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang, tại Đường Đệ – Nha Trang Với nguồn giống và kỹ thuật nuôi đã được chủ động sản xuất, một số vùng nuôi ở nước ta đã được chuyển giao công nghệ nuôi thương phẩm cá chim vây vàng

Đầu năm 2011, Trung tâm giống Hải sản tỉnh Nam Định đã nuôi thử nghiệm giống cá chim biển vây vàng trong ao đất và có hiệu quả cao Bên cạnh đó, ở Quỳnh

Lưu Nghệ An đang xây dựng mô hình nuôi thương phẩm cá chim vây vàng Hiện nay

cá chim vây vàng đang được nuôi thử nghiệm ở Phú Yên, Vũng Tàu, Nha Trang … và bước đầu đã mang lại hiệu quả

Trên thế giới và trong nước mới chỉ tập trung vào vấn đề sinh sản nhân tạo và kỹ thuật nuôi cá chim trắng vây vàng, trong khi đó cá chim trắng vây vàng nuôi lồng biển vẫn có thể đối diện với nguy cơ bệnh dịch và bị ảnh hưởng bởi các tác động từ môi trường tự nhiên Tuy nhiên từ trước đến nay, vấn đề nghiên cứu về thức ăn và bệnh dịch trên cá chim trắng vây vàng vẩn còn bỏ ngỏ, chưa có một nghiên cứu nào về lĩnh vực này được công bố

1.2.3 Tình hình bệnh dịch trên cá nuôi nước mặn nói chung và cá chim vây vàng nói riêng

Nuôi cá biển là nghề phát triển mạnh ở Việt Nam từ 30 năm nay và đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn nhưng trong thời gian gần đây đang có dấu hiệu dừng lại do dịch bệnh xảy ra nhiều, nguyên nhân gây bệnh bao gồm:

1.2.3.1 Bệnh do nấm, ký sinh trùng

Nấm là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh ở cá như: Bệnh nấm thủy mi – gây ra

do do 4 giống nấm Leptolegnia, Aphanomyces, Saprolegnia và Achlya; Bệnh nấm mang - gây ra bởi Branchiomyces Các loại nấm gây hại nhiều đối với nhiều loại cá

nuôi giai đoạn cá con, cá thịt và trứng cá Nấm gây bệnh trên cá làm cho cá bị ngứa ngáy, lở loét, kém ăn Biện pháp phòng và trị hiện nay thường dùng muối ăn ( NaCl) nồng độ 2-3% sulfate đồng ( CuSO4) nồng độ 0,5g/m3 nước để tắm cho cá nuôi

Ký sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên cá biển nuôi Nguyễn Thị Muội và Đỗ Thị Hòa (1978-1980) đã phát hiện được 80 loài ký sinh trùng ký sinh trên cá biển.

Nhiều loại ký sinh trùng như: ký sinh trùng đơn bào (Amyloodinium), ký sinh trùng bánh xe (Trichodiniosis), và các loại sán lá đơn chủ (Monogeneansis, Neobenedenia

girellae, Benedenia epinepheli và Benedenia sp) cũng là nguyên nhân gây ra một số

bệnh ở cá nuôi Mặc dù không gây tổn thất lớn nhưng nó làm cho cá chậm lớn, giảm chất lượng thịt cá, tạo cơ hội cho vi khuẩn và virus tấn công Biện pháp phòng ngừa các bệnh do ký sinh trùng thường là giữ vệ sinh ao cá nhất là ao ương, cải tạo ao nuôi

kỹ càng, thả cá với mật độ vừa phải và tẩy giun sán định kỳ cho cá nuôi bằng thuốc

1.2.3.2 Bệnh do virus

Virus là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên cá biển nuôi lồng bè Tuy nhiên ở Việt Nam tình hình nhiễm bệnh do virus ở trên cá nuôi vẫn chưa nghiêm trọng, các tác nhân virus gây bệnh thường gặp chủ yếu ở tôm nuôi như bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV), hội chứng Taura (TSV)…

Ở trên cá biển nuôi, tác nhân virus gây bệnh được ghi nhận nhiều là virus gây bệnh tử hoại thần kinh (VNN) Bệnh này gây ra trên nhiều loài cá biển và phân bố rộng

rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau (Takana và cộng sự 2003, 2004; Curtis và ctv 2001 ) Bệnh này đã được phát hiện trên các loại cá mú (Epinephelus spp.) cá chẽm (Lates calcarifer) và cá bớp (Rachycentron canadum) nuôi ở Khánh Hòa, Việt Nam (Trần Vĩ Hích và cộng sự, 2008) Một số bệnh do virus cũng gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi cá biển trên thế giới như virus IHN gây hoại tử cơ quan tạo máu ở cá hồi vân, iridovirus gây ra hiện tượng hoại tử mang và da ở cá tầm trắng Ngoài ra, một số

bệnh khác do virus cũng đã được ghi nhận ở các loài cá khác như bệnh nhiễm trùng

xuất huyết do vi rút do virus VHS gây nên ở cá hồi, cá trích, cá bơn; bệnh do RSIV ở

cá vược, cá tráp và cá mú song

Hiện nay chưa có biện pháp chữa trị cho bệnh bởi virus trên cá nuôi nên để giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh virus thì phải đảm bảo nguồn giống sạch virus và hạn chế nhập, xuất khẩu các loại cá có nguy cơ nhiễm virus đã biết

1.2.3.3 Bệnh do vi khuẩn

Hiện nay, bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề ương nuôi cá thương phẩm Nhiều bệnh trên cá nuôi lồng bè trên biển do vi khuẩn đã được ghi nhận như:

bệnh đốm trắng ở thận trên cá giò nuôi thương phẩm, bệnh Vibriosis, bệnh mòn vây

cụt đuôi và bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu ở cá mú, cá giò, cá chẽm ( Đỗ Thị Hòa

và cộng sự, 2008)

Theo thống kê Ở Khánh Hòa, có khoảng 30% hộ nuôi cá biển bị chịu tác hại của bệnh do vi khuẩn Bệnh có thể xảy ra ở nhiều loài cá biển nuôi như cá mú, cá chẽm, cá hồng, đặc biệt giai đoạn cá nhỏ (5-20cm), cá nuôi lồng thường chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn với tỷ lệ chết có thể đạt 50-100%, đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng (Đỗ Thị Hòa, 2008)

Các virus gây bệnh trên cá biển đã được biết như : Vibrio spp, Aeromonas spp,

Flexibacter sp, Pseudomonas fluorescents, Pseudomonas putida , Photobacterium damsela, (Đỗ Thị Hòa, 2008) Trong đó, nhóm vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh đang

được chú ý hơn cả vì tốc độ lây lan và mức độ ảnh hưởng nghiêm trọng của chúng trong nghề nuôi trồng thủy sản hiện nay

Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản

Bệnh vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do

vi khuẩn Vibrio spp gây ra Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ

cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh

vibriosis ở động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004)

Vibrio là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với động vật nuôi thủy sản V anguillarum, V salmonicida, và V vulnificus là ba trong số những tác nhân gây bệnh

chính cho vài loài cá ( Bùi Quang Tề , Phan Thị Vân và cộng sự, 1998) Số lượng chết gây ra bởi Vibrio trên cá và các loài sò hến là rất phổ biến trong giai đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ (Thompson và cộng sự,

2004)

Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá lồng trên biển phát triển mạnh, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản

(Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004) Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát được ở khắp

mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn, sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ

Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang được nuôi phổ biến ở nhiều quốc

gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thường bị bệnh này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển (Liopo và cộng sự, 2001) Bệnh

thường thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị

Hòa và cộng sự, 2004) Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V alginolyticus, và V anguillarum (Phan Thị Vân và cộng sự, 2000) Ngoài ra có những thông báo khác về bệnh do Vibrio ở cá như vi khuẩn V anguillarum, V vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình, V

salmonicida gây bệnh ở cá vùng nước lạnh (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004)

Tình hình bệnh dịch và nguyên nhân gây bệnh ở trên các loài cá nuôi thương phẩm như cá mú, cá chẽm, cá giò đã được nhiều nghiên cứu công bố Tuy nhiên do cá chim vây vàng mới được đưa vào nuôi thương phẩm trong thời gian gần đây nên chưa có nghiên cứu cụ thể về dịch bệnh được công bố, nhưng qua thực tiễn nuôi cá chim trắng vây vàng ở lồng bè trên biển, chúng tôi quan sát thấy số lượng cá bị hao hụt do bệnh tật là tương đối lớn Chúng tôi cũng đã tiến hành thu mẫu cá chim trắng vây vàng bị bệnh đem về phân lập các chủng gây bệnh, kết quả là có rất nhiều vi khuẩn thuộc

Vibrio spp đã được phân lập, đây là một cơ sở để kiểm tra và xem xét các tác nhân vi

khuẩn gây bệnh trên loài cá này trong tương lai Để làm sáng tỏ vấn đề này thì cần các nghiên cứu cụ thể để đánh giá cũng như đưa ra các biện pháp khắc phục để nghề nuôi thương phẩm cá chim trắng vây vàng được phát triển mạnh

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.3.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic 1.3.1.1 Giới thiệu chung

Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà, …), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản

xuất axit lactic và các loại muối của axit lactic Ngay từ năm 1780 nhà hóa học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic 21 năm sau (1878) Lister đã phân lập

được vi khuẩn lactic và đăt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococus lactic

) và ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã hình thành từ năm 1881

Những vi khuẩn gây lên men lactic được gọi là vi khuẩn lactic, chúng có thể lên men được các loại đường monosacarit, disacarit nhưng không lên men được tinh bột

Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu ( hoặc oval) và hình que, đường kính của các dạng lactic thường từ 0.5 – 1.5 µm, các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic khoảng 1 – 8 µm, trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi Tất cả các vi khuẩn lactic đều không chuyển động, không sinh bào tử, G+, kỵ khí tùy tiện vi hiếu khí Trực khuẩn thường nhạy cảm hơn so với liên cầu khuẩn Vi khuẩn lactic lên men được monosaccarit và disaccarit nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men được bất kỳ loại disaccarit nào, một số không lên men được saccaroza, một số không sử dụng được

latose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột ( trừ chủng Lactobacillus

delbruceckii) và các polysaccarit khác

Khả năng tạo thành axit lactic của các loài vi khuẩn lactic khác nhau thi rất khác nhau và như vậy độ bền với axit này cũng rất khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo được axit lactic cao, các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH = 3,8 – 4 còn cầu khuẩn không thể phát triển trên môi trường này, hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn là ở pH = 5 – 6

Đa số vi khuẩn lactic đặc biệt là trực khuẩn lactic đồng hình rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương đối đầy đủ các axit amin hoặc các hợp chất Nitơ phức tạp hơn Ngoài ra chúng còn có nhu cầu về vitamin ( B1, B6 , PP, các axit pantotenic, axit folic …) Vì vậy môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic khá phức tạp Chính các đặc điểm dinh dưỡng về axit amin và

vitamin cho nên nhiều chủng vi khuẩn lactic được dùng trong phân tích hai dạng hợp chất này ở các cơ chất khác nhau

Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptit, axit amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn

Vi khuẩn lactic chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vận sống được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 – 10 % NaCl

Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 – 350C, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 450C, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối thấp ( <= 50C) Khi gia nhiệt đến 60 – 800C thì hầu hết bị chết sau 10 – 30 phút

Một số vi khuẩn lactic có khẳ năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm Như vậy ngoài khẳ năng tạo ra axit lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh ( Bacterioxin)

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp trong không khí, đất, nước nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm thực phẩm (rau quả, sữa, thịt,…) một số tìm thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật

1.3.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic

Người ta dựa vào quá trình lên men chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình

1.3.1.2.1 Lên men đồng hình

- Lactobacterium casei: đây là những trực khuẩn rất ngắn gây chua sữa tự nhiên

Yếm khí tuỳ tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8 ÷ 1% axit lactic Ở điều kiện bình thường gây chua sữa trong vòng 10 đến 12 giờ Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 100C, tối ưu là 350C và tối đa là 450C, chúng thuỷ phân cazein và gelatin rất yếu

- Streptococcus cremoris: Thường tạo thành chuỗi dài, thường phát triển ở nhiệt độ thấp hơn Lactobacterium casei, tối ưu từ 250C ÷ 300C, lên men glucose, galactose

- Lactobacterium bulgaricus: đây là trực khuẩn rất dài, nhiệt độ phát triển tối ưu

là 200C, có khả năng lên men glucose, lactose Có khả năng tạo độ axit cao (3,7% axit lactic)

- Lactobacterium delbruckii: thường gặp trên hạt đại mạch, đây là trực khuẩn

lớn Trong quá trình phát triển của mình chúng có khả năng tạo thành sợi Nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển từ 45 ÷ 500C, khác với các loài khác chúng không có khả năng lên men đường lactose vì vậy chúng không được dùng trong chế biến sữa

- Lactobacterium cueumeris fermenti: thường tìm thấy chúng trong sữa ủ chua

Là trực khuẩn không chuyển động, thường tạo thành tế bào đơn và có khi tạo thành chuỗi Thường chúng tạo thành chuỗi trong quá trình lên men Khả năng tạo axit tối đa trong môi trường từ 0,9 ÷ 1,2%

1.3.1.2.1 Lên men dị hình

- Streptobacterium hassice fermentatae: thường thấy chúng trong các dịch lên

men chua rau cải Chúng tồn tại từng tế bào riêng biệt hoặc ghép thành từng đôi, hoặc chuỗi ngắn có khi ghép thành từng chuỗi dài hình sợi Khi lên men rau cải chua tạo thành axit lactic, axit axetic, rượu etylic và CO2 Lên men đường saccarose tốt hơn lên men đường lactose

- Lactobacterium lycopersici: là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo

thành chuỗi hay đơn, có khi ghép thành đôi một Khi lên men chúng tạo thành axit lactic, rượu êtylic, axit axetic và CO2 Chúng có khả năng tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng thường chết ở nhiệt độ 800C

1.3.2 Giới thiệu về giống Lactobacillus

Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, kích thước lớn (0,5 - 0,7 × 2 - 8 μm), đại

bộ phận các loài không di động, không sinh bào tử, có dạng hình que hay hình cầu Chúng có những nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp và làm lên men hoàn toàn, hiếu khí

hay kị khí, ưa axit.( De Man và cộng sự, 1960) Nhiệt độ phát triển tối thích thường là

30 – 350 C Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng hay đục sữa

Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất axit lactic là một sản phẩm phụ

của quá trình chuyển hóa glucose

-Lactobacillus được tìm thấy trong các môi trường sống có chứa nhiều

cacbohydrat và phân bố rộng khắp trong thức ăn, thức ăn ủ chua, phân bón, sữa và các sản phẩm sữa và trong đường ruột người, động vật, thủy sản…

-Nhiều loài Lactobacillus được sử dụng thương mại trong việc sản xuất các loại

sữa chua, pho mát và sữa chua, và họ có một vai trò quan trọng trong sản xuất rau quả lên men (dưa chua và dưa cải bắp), đồ uống (rượu vang và nước trái cây), bánh mì bột

chua, và một số xúc xích Ngày nay Lactobacillus được sử dụng trong chế phẩm

probiotic cho cả con người và vật nuôi Đặc biệt, trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản chế phẩm probiotic đang được phát triển và ứng dụng ngày càng rộng rãi

1.3.2.1 Giống Lactobacillus – các đặc tính của vi khuẩn probiotic

1.3.2.2.1 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh

Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với nhiều

vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và kể cả nấm Lactobacillus có khẳ năng sinh ra các chất

kháng khuẩn bao gồm: các axit hữu cơ (axit lactic và axetic axit), hydrogen peroxit, cacbondioxit, và diaxetyl cũng như bacterioxin và các hợp chất giống bacterioxin (

Mishra và Lambert, 1996; Ouwehand và cộng sự, 1999) Cả axit lactic và axit axetic

đều có khẳ năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính điều này đã ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác (Mishra và Lambert, 1996) Hydrogen peroxit ức chế được sự phát triển của cả vi khuẩn Gram(+) và Gram(-) (Hollang, Knapp, và Shoesmith, 1987; Mishra và Lambert, 1996) Diacetyl tác động ức chế lên sự tăng trưởng bằng cách can

thiệp sử dụng arginine (Jay, 1986)

Ngoài ra Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacterioxin, một loại protein có

khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm

của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Bacterioxin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh

như: E.coli; Samonella; Vibrio; Campylobacter, Shigella, Vibrio, Clostridium,

Candida albicans, và một số virus khác nữa (O’Sullivan và Kullen, 1998)

1.3.2.2.3 Khả năng chịu mặn

Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố đầu

tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho NTTS ở các vùng khác nhau

Một số chủng Lactobacillus đã được biết với khả năng chịu độ mặn cao, cao hơn rất nhiều so với độ mặn trung bình từ 3,1‰ tới 3,8‰ của nước biển như:

- L amylovorus DCE 471có thể tồn tại và sinh ra bacterioxin trong môi trường

3 % (w/v) NaCl (Patricia Neysens và cộng sự, 2003)

- Lactobacillus sakei có thể sống trong môi trường có độ mặn rất cao 9% NaCl (Chaillou và cộng sự, 2005)

1.3.2.2.4 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa

Trong các điều kiện invitro, nhiều chủng Lactobacillus đã được tuyển chọn với

khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đường ruột động vật thủy sản như môi trường axit HCl ở dạ dày, môi trường kiềm của ruột, lyzozyme, dịch tụy, dịch mật (Srikanjana Klayraungvà cộng sự, 2008 ) Khả năng tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa giúp cho các vi sinh vật probiotic có thể cạnh tranh được vị trí bám dính và các nguồn dinh dưỡng, năng lượng với các vi khuẩn gây hại

Một số chủng Lactobacillus có khả năng tồn tại tốt trong đường tiêu hóa đã được phân lập như: L curvatus, L reuteri, L.plantarum, L parapentarum, L pentosus,

L keferi, L fermentum, L animalis, L.mucosae, L aviaries ssp aviaries, L.salivarius

ssp salicinus, L salivarius ssp.L.salivarius, L hilgardii, and L panis (Srikanjana Klayraung và cộng sự, 2008 )

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn lactic nói chung và

Lactobacillus nói riêng

1.3.2.1.1 Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004) Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này

• Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Cacbon là thành tố chính trong các hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể của mọi loài sinh vật Vì vậy sự chuyển hoá nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật

Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose (glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)

+ Glucose ở dạng D- glucose, là loại monosaccarit hấp thụ dễ dàng nhất Chúng được vi sinh vật sử dụng đầu tiên rồi mới đến các loại khó chuyển hoá hơn Vì vậy trong quá trình sản xuất người ta thường đưa về loại đường này cho vi sinh vật dễ sử dụng

+ Lactose là disaccarit, nó là đường có trong sữa người và động vật Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng lactose làm thức ăn vì chúng có khả năng sinh enzym β-galactosidase Enzym này thuỷ phân lactose thành glucose và galactose, giúp cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn được dễ dàng hơn

+ Sucrose cũng là một disaccarit Trong quá trình lên men dưới tác dụng của enzym sucrose hydrolase bị thuỷ phân thành glucose và fructose Vài loài lactococci, saccarose được vận chuyển bởi hệ enzym sucrose phosphotransferase và một enzym

đặc hiệu sucrose-6-phosphate hydrolase phân cắt sucrose-6-phosphate thành phosphate và fructose Những enzym này chỉ được tiết ra khi xuất hiện sucrose trong môi trường (Thompson và Chassy, 1981)

+ Maltodextrin là sản phẩm trung gian khi thuỷ phân tinh bột thành đường, có 20 chuỗi Những chuỗi này được tạo bởi vài gốc dextroza liên kết với nhau bởi liên kết hidro yếu

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccrit và disaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic… Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm thực phẩm, có thể sử dụng các axit gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axit axetic và axit lactic Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng Khi đó tạo ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO2 Các loại vi khuẩn khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau Một số loài vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột (William và Wilkins, 1986) Sự phát triển của vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các quá trình xử lý sau này Nhóm các nhà khoa học của Carcalho đã khẳng định rằng khả năng sống

sót của L bulgaricus trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ

sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men từ manose thì tỷ lệ tế

bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructose và lactose (Carvalho và cộng sư,

2004) Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào

• Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của tất cả sinh vật Vật chất cơ bản của tế bào (protein, axit nucleic…) đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóng vai trò hết sức