Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở các nồng độ muối NaCl khác nhau, lắc ở 180 vòng/phút, 370C trong 24h. kiểm tra khả năng sống sót của hai chủng Lactobacillus bằng giá trị OD600 nm.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập tuyển chọn
3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng
Các mẫu cá chim vây vàng được từ trại cá Trường Đại học Nha Trang tại Vũng Ngán (Nha Trang – Khánh Hòa), chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 11 chủng
Lactobacillus. Phân lập và thuần khiết Lactobacillusđã được tiến hành trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37oC. Các chủng Lactobacillus được đặt tên theo thứ tự L1.1, L1.2, L1.3, L1.4, L1.5, L2.1, L2.2, L2.3, L2.4, L2.5, L2.6.
3.1.2. Kết quả tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio
Các chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường lỏng MRS, lắc với tốc độ
180 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28-30oC). Các chủng Vibrio được tiến hành đồng thời, nuôi trên môi trường APW, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28-30oC). Tiến hành thử hoạt tính kháng Vibrio của Lactobacillus sau khi các chủng Lactobacillus và
Vibrio đã được nuôi khoảng 18 – 22 giờ. Trang đều 0,1ml chủng Vibrio lên bề mặt đĩa thạch MRS, đục các lỗ có đường kính 5 mm lên môi trường đã cấy Vibrio và cho 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus vào lỗ thạch. Các đĩa petri được ủ ở nhiệt độ
37oC trong tủ ấm.
Tính đối kháng của các chủng Lactobacillus được đánh giá thông qua kích thước vòng kháng khuẩn (D – d, mm), trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn, d là đường kính lỗ thạch. Sau 1 – 2 ngày nuôi cấy, các đĩa nuôi cấy được đem ra đọc kết quả. Kết quảđược thể hiện ở từ bảng 3.1 và hình 3.1:
0 5 10 15 20 25 L 1.2 L 1.3 L 1.4 L 1.5 L 2.2 Chủng Lactobacillus Ho ạ t t ính k h á ng Vi b ri o D - d (m m ) V 2.1 V 2.2 V 2.3 V 2.4 C 1 C 7 C 23
Bảng 3.1: Hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio của 5 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37oC
D – d (mm) V 2.1 V 2.2 V 2.3 V 2.4 C 1 C 7 C 23 L 1.2 15 14 20 18 15 22 20 L 1.3 18 16 14 22 10 24 21 L 1.4 11.5 16 13 12 10 13.5 17 L 1.5 10 14.5 16.5 10 12 11 18.5 L 2.2 13 14 16 12.5 13 10 10.5 Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1, C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định bằng
Hình 3.2:Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC
. Kết quả từ bảng 3 cho thấy có 5 chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng
Vibrio, chiếm 45,45%. Qua bảng 3, hình 3.1 và hình 3.2 cho thấy chủng Lactobacillus L1.2 và L1.3 có khả năng kháng Vibrio mạnh nhất, thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất. Từ kết quả trên chúng tôi chọn hai chủng L1.2 và L1.3 để làm các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa 3.2.1. Đặc điểm hình thái 3.2.1. Đặc điểm hình thái
3.2.1.1. Đặc điểm hình thái của chủng L1.2
Chủng L1.2được cấy trang trên môi trường MRS bổ sung agar 2%, để trong tủ ấm 370C. Sau 24h nuôi, lấy đĩa petri ra quan sát hình thái khuẩn lạc.
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C
Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X
L1.2
Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram của chủng L1.2
Kết quả cho thấy: Chủng L1.2 có khuẩn lạc tròn, có đỉnh nhọn, màu trắng nhạt, khuẩn lạc sau 24 h nuôi cấy có kích thước khoảng 2mm.
Khi làm tiêu bản soi tươi và nhuộm gram quan sát hình thái tế bào của chủng L1.2, kết quả trên hình 3.4 và hình 3.5: tế bào có dạng hình cầu, đứng đơn, xếp chuỗi, tụ thành đám. Tế bào bắt màu tím của thuốc nhuộm gram, điều đó chứng tỏ chủng LP2 là vi khuẩn gram dương.
3.2.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng L1.3
Chủng L1.3 được cấy trang trên môi trường MRS bổ sung agar 2%, để trong tủ ấm 370C. Sau 24h nuôi, lấy đĩa petri ra quan sát hình thái khuẩn lạc.
Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C
Hình 3.7: Hình thái tế bào của chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X
L1.3
Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3
Kết quả nuôi cho thấy:
Chủng L1.3 có khuẩn lạc tròn, có màu trắng đục sữa, bề mặt trơn bóng, kích thước khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy khoảng 2,2 mm.
Chủng L1.3 Tế bào có dạng hình que dài 1-2μm, đứng đơn, xếp đôi, tạo chuỗi, bắt màu tím của thuốc nhuộm gram. Kết luận chủng L1.3 là trực khuẩn, gram dương.
3.2.2. Đặc điểm sinh hóa
Song song với các thí nghiệm xác định đặc điểm hình thái của 2 chủng, chúng tôi đồng thời tiến hành kiểm tra khả năng sinh axit lactic, khả năng tạo catalase, khả
năng di động của 2 chủng L1.2 và L1.3. Thử catalase bằng cách nhỏ H2O2 vào khuẩn lạc, không thấy sủi bọt là catalase âm tính. Thử khả năng sinh axit lactic bằng phương pháp cho tạo phức với phenol. Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp cấy đâm sâu trên môi trường thạch đứng. Kết quả thử nghiệm khả năng di động được thể hiện trên hình 3.9; hình 3.10 và khả năng lên men các lọai đường ở bảng 3.2:
Hình 3.9: Khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3
L1.2 L1.3
Bảng 3.2: Kết quả thử các đặc tính của hai chủng L1.2 và L1.3
Kết quả thí nghiệm cho thấy L1.2 và L1.3: là những vi khuẩn có sinh axit lactic, gram dương, catalase âm tính, không di động, không tạo bào tử.
Theo khóa phân loại Bergey có thể kết luận 2 chủng L1.2 và L1.3 đều là những vi khuẩn lactic.
Hai chủng L1.2 và L1.3 được lựa chọn này sẽ đem đi là các thí nghiệm tiếp theo.
3.3. Đặc tính nuôi cấy và đặc tính probiotic
3.3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3
Xác định đường cong sinh trưởng của các chủng giúp ta kiểm soát quá trình nuôi cấy và xác định thời gian thích hợp nhất cho quá trình thu sinh khối.
Chúng tôi tiến hành xác định đường cong sinh trưởng ở môi trường MRS lỏng, pH 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 370C ± 2. Được xác định đến 30h, cứ 3h lấy mẫu một lần đo OD.
Chủng L1.2 L1.3
Khả năng sinh axit lactic + +
Gram + +
Khả năng di động - -
Hoạt tính catalase - -
Khả năng sử dụng các đường + +
a)ChủngL1.2 0.34 2.31 2.44 2.43 2.35 2.41 2.46 2.42 2.13 1.71 0.83 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 5 10 15 20 25 30 35 Time (h) O D ( 600 n m )
Hình 3.11: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 nm của chủng L1.2
Nhìn vào hình 3.11 có thể thấy chủng L1.2 đạt đến pha cân bằng ở 18h. Mật độ
tế bào đạt giá trị lớn nhất ở 21 – 24h. Ở 27h – 30h tế bào bắt đầu già và chết dần. Nhự
vậy ta có thể thu sinh khối ở 21 – 24h. b)ChủngL1.3 0.47 1.03 2.47 2.45 2.23 1.88 2.5 2.53 2.51 2.49 2.41 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 5 10 15 20 25 30 35 Time (h) O D ( 600)
Nhìn vào hình 3.12 có thể thấy chủng L1.3 đạt đến pha cân bằng ở 15h. Mật độ
tế bào đạt giá trị lớn nhất ở 18h – 21h. Ở 27h – 30h tế bào bắt đầu già và chết dần. Như
vậy ta có thể thu sinh khối ở 18 – 21h.
Qua kết quả trên chúng ta thấy cả 2 chủng đều bỏ qua giai đoạn thích ứng. Điều này dễ giải thích bởi môi trường hoạt hóa giống không khác nhiều với môi trường lên men. Giai đoạn phát triển logarit ngắn, điều này có lợi cho quá trình sản xuất thu sinh khối, rút ngắn được thời gian lên men. Giai đoạn cân bằng dài chứng tỏ chủng có khả
năng duy trì phát triển tốt. Điều này thuận lợi cho quá trình sản xuất xử lý thu sinh khối.
3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độđến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Ở nhiệt độ
thấp sẽ kéo dài thời gian sinh trưởng do đó kéo dài thời gian thu sinh khối. Còn ở nhiệt
độ quá cao chủng sẽ bịức chế. Với mục đích thu sinh khối lớn trong thời gian ngắn ta cần tìm nhiệt độ tối thích nhất cho chủng phát triển đạt yêu cầu mong muốn của nhà sản xuất.
Để tìm khoảng nhiệt độ tối thích chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường MRS lỏng tại các khoảng nhiệt độđược khảo sát là: 300C; 340C; 370C và 400C. Với pH là 6,5. Kết quả được đo sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng
2 2.5 3 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 Nhiệt độ O D 60 0 n m L1.2 L1.3
Hình 3.13 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độảnh hưởng đến sự phát triển của hai chủng L1.2 và L1.3, hai chủng đều là các vi khuẩn ưa ấm
Đối với chủng L1.2 nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chủng là ở 35 -370C mạnh nhất ở 370C , ở nhiệt độ từ 37 – 40oC chủng đã bịức chế bởi nhiệt độ. Do vậy để đáp ứng mục tiêu của sản xuất là sinh khối chúng tôi chọn nhiệt độ 370C làm nhiệt độ
thích hợp cho chủng L1.2 phát triển.
Chủng L1.3 phát triển tốt ở 33 - 350C và mạnh nhất ở 340C, sau 350C thì chủng L1.3 phát triển kém dần. Chúng tôi chọn nhiệt độ 340C cho mục tiêu sản xuất thu sinh khối của chủng L1.3.
3.3.3. Thời gian nuôi cấy
Trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm việc xác định thời điểm thu nhận sinh khối có vai trò rất quan trọng, nó không chỉ có ý nghĩa trong việc rút ngắn thời gian sản xuất mà còn ảnh hưởng tới chất lượng chế phẩm sau này. Việc nghiên cứu thời gian nuôi cấy được thực hiện trên môi trường MRS với tỷ lệ tiếp giống là 10%. Thực hiện quá
trình nuôi cấy tĩnh trong tủ ấm, chủng L1.2 nuôi ở 370C và chủng L1.3 nuôi ở 340C, theo dõi kết quảđo OD600nm sau thời gian từ 8h đến 40h.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 10 20 30 40 50 Time (h) O D 600 n m L1.2 L1.3
Hình 3.14: Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào sống của hai chủng L1.2 và L1.3 ở OD600 nm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng L1.2 phát triển và cho sinh khối lớn nhất trong khoảng từ 24 - 28 h nuôi cấy, chủng L1.3 cho sinh khối lớn nhất trong khoảng thời gian từ 20 – 24h nuôi cấy. Thời gian này chậm so với đường cong sinh trưởng khoảng 3h nuôi. Nguyên nhân dẫn đến sự chênh lệch này là do quá trình nuôi để lấy sinh khối này được thực hiện trên thể tích lớn hơn rất nhiều ,so với thể tích nuôi để xác
định đường cong sinh trưởng là 200 ml thì thể tích nuôi sinh khối là 1 L. khi thể tích nuôi cấy lớn thì sựảnh hưởng của các chất ức chế như axit lên vi sinh vật sẽ yếu hơn vì vậy thời gian phát triển để thu được sinh khối lớn nhất sẽ kéo dài hơn.
Từ kết quả trên, chúng ta sẽ xác định thời gian nuôi cấy thu nhận sinh khối trên quy mô lớn hơn trên quy mô công nghiệp.
3.3.4. pH nuôi cấy
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3 trong môi trường MRS lỏng. Dải pH được khảo sát từ 4 – 8, chủng L1.2 được
nuôi cấy ở nhiệt độ 370C và chủng L1.3 nuôi ở 340C trong 48h. Cứ 3h lấy mẫu đo OD một lần. Kết quảđược biểu diễn trên hình 16, ở 24h. 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2 3 4 5 6 7 8 9 pH O D 6 00n m L1.2 L1.3
Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Từ hình 3.15 ta thấy rằng pH ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của cả 2 chủng.
Chủng L1.2 phát triển tối thích ở pH = 6 – 7 , tốt nhất ở pH = 7. Ở pH = 8 chủng bắt đầu có dấu hiệu phát triển kém hơn Khoảng pH từ 5 – 6 chủng vẫn phát triển được nhưng ở pH từ 4 – 4,5 sự phát triển của chủng đã bịức chế.
Chủng L1.3 thì phát triển tốt ở pH = 6 – 7.5 và tối thích ở pH = 6.5. Ở pH = 8 chủng vẫn phát triển nhưng kém hơn, ở pH = 4 – 6 chủng phát triển yếu dần.
Qua khảo sát ta thấy rằng hai chủng phát triển tốt ở pH trung tính và hơi kiềm. Điều đó chứng tỏ chủng rất thích hợp phát triển trong môi trường nước biển.
Dựa vào sự khảo sát pH chúng tôi chọn pH = 6,5-7 làm pH môi trường cho quá trình lên men thu sinh khối 2 chủng L1.2 và L1.3.
Với mục đích ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic làm chế phẩm probiotic cho nuôi trồng thuỷ sản. Do vậy, ta cần kiểm tra khả năng chịu mặn của các chủng L1.2 và L1.3. Thí nghiệm được kiểm tra trong môi trường MRS với độ mặn khác nhau. Kết quả
cho trên hình 3.16. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 1 2 3 4 5 Nồng độ muối NaCl (%) O D 600n m L1.2 L1.3
Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3
Chủng L1.2 có khả năng phát triển ở nồng độ muối 5%. Sự phát triển của chủng tỷ lệ nghịch với độ mặn của môi trường.
Chủng L1.3 có khả năng chịu mặn yếu hơn, mật độ tế bào giảm dần ở các nồng
độ muối cao hơn và đến 5% muối thì sự phát triển của chủng L1.3 rất yếu ( OD600 = 0.95). Tuy nhiên ở nồng độ muối 1% thì chủng phát triển yếu hơn ở nồng độ muối 2%,
điều này chứng tỏ nồng độ muối NaCl có ảnh hưởng đến sự phát triển của L1.3.
Chúng ta nhận thấy 2 chủng đều có khả năng chịu mặn khá tốt, đặc biệt chủng L1.2 có khả năng chịu mặn tương đối cao 5%( so với độ mặn trung bình của nước biển là khoảng 3%). Đây là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho NTTS ở các vùng khác nhau.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ các mẫu cá chim vây vàng được lấy từ Trại cá Trường đại học thủy sản Nha Trang (tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa) phân lập được 5 chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio spp.
2. Trong năm chủng có hoạt tính kháng Vibrio spp , hai chủng L1.2 và L1.3 có hoạt tính kháng mạnh nhất sau 24h nuôi cấy.
3. Các điều kiện thích hợp cho 2 chủng phát triển:
- Chủng L1.2: nhiệt độ 370C, pH= 6.5 - 7 , thời gian thu sinh khối 24 - 28h, khả năng chiu mặn đến 5%.
- Chủng L1.3: nhiệt độ thích hợp 340C, pH= 6 - 7, thời gian thu sinh khối 20 – 24h, khả năng chịu mặn đến 5%.
4. Hai chủng L1.2 và L1.3 được nghiên cứu có các đặc điểm sinh học của chi vi khuẩn Lactobacillus gồm: hình que, không di động, sinh axit lactic, lên men các loại đường (glucose, saccharose, sucrose, mantose, manitol, sorbitol).
Kiến nghị
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
1. Sử dụng hai chủng L1.2 và L1.3 vào chế phẩm probiotic để thử nghiệm invivo trên cá chim vây vàng.
2. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng khuẩn của các chủng Lactobacillus 3. Giải trình tự gene hai chủng Lactobacillus nói trên
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt:
1. Bộ thủy sản (2004), “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm thủy sản, dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản”, NXB nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội, 296 tr.