- Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của men catalase.
- Cơ sở sinh hóa: Do oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang tính độc
đối với vi sinh vật, không có gì ngạc nhiên là vi sinh vật cũng có thể tự “giải độc” bằng cách tạo ra những men có khả năng phá hủy một số sản phẩm chứa oxy như vậy. Điển hình của loại men này là catalase. Men catalase có ở hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa cytochrome.
- Phương pháp thử: Thử trên lam: Dùng que cấy lấy tâm khuẩn lạc thuần đã nuôi trên môi trường MRS đặc đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khuẩn lạc nằm trên lam kính. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có enzym catalase trong tế bào.
- Lưu ý:
+ Khi thử nghiệm trên lam không được đảo trộn trình tự tiến hành ( không đưa H2O2 lên lam kính trước vi sinh vật) bởi cả sắt lẫn platinum co trong que cấy đều có thể gây phản ứng dương tính giả.
+ Nên dùng các khuẩn lạc đã nuôi trong thời gian 18 – 24 giờ vì những khuẩn lạc già hơn có thể gây mất hoạt tính catalase và gây phản ứng âm tính giả. + H2O2 30% rất không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng nên cần giữ lạnh dung dịch và cần kiểm tra hoạt tính trước khi dùng.
2.3.2.2.3. Khả năng di động
Chủng Lactobacillus được cấy đâm sâu trong môi trường thạch đứng. Chuẩn bị
các ống nghiệm chứa môi trường MRS đặc, cao 5 - 6cm. Dùng que cấy đầu nhọn chấm vào dịch nuôi rồi đâm sâu thẳng xuống ống thạch đứng chứa môi trường MRS rắn. Nuôi ở 30 – 350C trong 2 ngày đem ra quan sát.
Nếu vi khuẩn mọc dọc theo vết cấy và mọc lan ra xung quanh, chứng tỏ chủng có khả năng di động.
Vi khuẩn mọc trên bề mặt ống thạch chứng tỏ chủng hô hấp hiếu khí.
2.3.2.2.4. Khả năng sử dụng các loại đường:
Sử dụng môi trường cơ bản gồm có:Cao thịt- 3 g; Pepton- 10 g; NaCl- 5 g; phenol đỏ – 0,03g; thêm nước cất đến 1000 ml. Bổ sung đường với nồng độ 0,5% và chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 10 phút ở 121 0C. Đường arabinose, xylose, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ
sung vào môi trường.
Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị sẽ chuyển màu vàng lục.
Các loại đường được kiểm tra là: glucose, lactose, mantose, manitol, saccarose, sucrose.
2.3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy 2.3.3.1. Xác định khả năng sinh trưởng
Chủng Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở 20 -300C, lắc 180 vòng/phút. Tiến hành lấy mẫu lúc đầu và sau 3h nuôi cấy để xây dụng đường cong sinh trưởng bằng phương pháp đo độđục (∆OD600).
Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Giá trị OD (optical density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trưởng càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 500 – 610 nm.
Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy Lactobacillus bằng máy quang phổ. Cho môi trường vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 600 nm, đưa về giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy Lactobacillus cho vào cuvet số 2 và cho vào máy
đo, đọc kết quả hiện trên màn hình.
2.3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm 2/3 thể tích bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10 %. Tiến hành nuôi cấy hai chủng
Lactobacillus ở các mức nhiệt độ 300, 330, 370, 400. Cứ sau 12 giờ và 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đo pH và OD600 nm.
2.3.3.3. Xác định thời gian nuôi cấy
Sau khi chọn được nhiệt độ thích hợp cho từng chủng Lactobacillus ta tiến hành thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thu sinh khối tối ưu cho từng chủng. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm khoảng 2/3 bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10%. Tiến hành đo pH và OD600 sau 0, 8, 12, 16, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 giờ nuôi cấy.
2.3.3.4. Xác định pH thích hợp
Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng với lượng môi trường khoảng 2/3 thể tích bình nuôi cấy. Chỉnh pH môi trường vềở các mức pH = 4, 5, 6, 7, 8 và cho 10 % giống vào nuôi cấy ở nhiệt độ và pH thích hợp đã được chọn. Tiến hành đo pH và OD600 sau 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32h nuôi cấy.
2.3.4. Xác định các đặc tính probiotic