Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng một số vi khuẩn có khả năng phân giải xenlulo, góp phần xử lý rác thải sinh hoạt

Môi trường hiện nay đang trở thành vấn đề mang tính toàn cầu. Nó đòi hỏi phải có sự phối hợp chặt chẽ, lâu dài, sự đầu tư hợp lý, đồng bộ nhằm giảm thiểu những ảnh hưởng có hại gây sự suy thoái và huỷ hoại môi trường. Cùng với sự phát triển của Khoa học- Công nghệ mức độ đô thị hoá ngày càng nhanh chóng, nhu cầu của con người cũng tăng rất nhanh trong những năm gần đây. Từ thực tiễn, do chất thải rắn chỉ được thu gom, mà không được phân loại và xử lý tại nguồn phát sinh nên đ• gây ô nhiễm môi trường ở tất cả các khâu: từ thu gom, lưu giữ trong nhà, rơi v•i trên đường phố trong vận chuyển đến ô nhiễm tại b•i rác. Nếu cứ giữ nguyên phương thức thu gom xử lý chất thải rắn như hiện nay thì quy mô b•i rác cứ ngày càng tăng, chi phí cho xây dựng các b•i chứa rác càng lớn. Vấn đề di chuyển, quy hoạch một b•i rác mới không phải là đơn giản. Chất thải rắn sinh hoạt là mối quan tâm không chỉ của các nhà quản lý, các nhà khoa học mà cả chính của người dân ở địa bàn sinh sống. Vấn đề đặt ra là cần có một phương pháp xử lý rác thải phù hợp, tiện lợi, dễ tiến hành nhất, nhằm giữ gìn môi trường cảnh quan đồng thời giảm thiểu mức độ ô nhiễm. Dựa trên quan điểm đó, với hướng cần phân loại rác thải để phục vụ cho mục đích phân huỷ bằng phương pháp sinh học. Trong nội dung khoá luận này, chúng tôi tập trung nghiên cứu : Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng một số vi khuẩn có khả năng phân giải xenlulo, góp phần xử lý rác thải sinh hoạt

Mục lục Mở đầu Phần 1:Tổng quan 1.1. Rác thải sinh hoạt 1.1.1.Nguồn gốc 1.1.2. Thành phần rác thải sinh hoạt 1.1.3.Phân loại 1.2. Vi sinh vật và vai trò của vi sinh vật trong các chu trình biến đổi chất 1.2.1. Vi sinh vật 1.2.2. Vai trò của vi sinh vật vòng tuần hoàn chuyển hoá nguyên tố cacbon 1.2.2.1. Sự phân giải các hợp chất Gluxit 1.2.2.1.1. Sự phân giải các hợp chất đờng 1.2.2.1.2. Sự phân giải tinh bột 1.2.2.1.3. Sự phân giải Xenlulo 1.2.2.1.4. Sự phân giải Xilan 1.2.2.1.5. Sự phân giải Lignin 1.2.2.2. Sự phân giải Lipit 1.2.2.3. Sự phân giải Protein 1.2.3. Vi sinh vật vòng tuần hoàn chuyển hoá Nitơ 1.2.4. Vi sinh vật vòng tuần hoàn chuyển hoá Photpho 1.2.5. Vi sinh vật vòng tuần hoàn chuyển hoá Lu huỳnh 1.3. Phơng pháp xử lý rác thải sinh hoạt 1.3.1. Xử lý chất thải hữu cơ trong điều kiện hiếu khí 1.3.2. Xử lý chất thải hữu cơ trong điều kiện kị khí 1.3.3. Nhu cầu các chất dinh dỡng của vi sinh vật 1.4. Các yếu tố ảnh hởng đến quá trình xử lý 1.4.1. Các yếu tố ảnh hởng đến quá trình ủ rác 1.4.2. Các yếu tố ảnh hởng đến quá trình xử lý nớc rác phần 2: Thực nghiệm 2.1. Mục đích của thực nghiệm 1 2.2. Một số phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học 2.2.1. Phơng pháp chuẩn bị môi trờng dinh dỡng 2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ 2.2.2.1. Rửa dụng cụ thuỷ tinh 2.2.2.2. Làm nút bông và bao gói 2.2.2.3. Khử trùng dụng cụ thí nghiệm 2.2.2.4. Phơng pháp tạo môi trờng 2.2.3. Tiến hành phân lập vi khuẩn 2.2.4. Phơng pháp nuôi cấy 2.2.5. Tinh sạch 2.2.6. Xác định hoạt tính phân huỷ Xenlulo của vi khuẩn bằng phơng pháp đặt thạch 2.2.7. Hoá chất và dụng cụ 2.3. Phơng pháp phân tích xác định chỉ số COD và nồng độ amoni, nồng độ Nitrat 2.3.1. Xác định chỉ số COD 2.3.2. Xác định amoni trong nớc rác 2.3.3. Xác định Nitrat 3. Kết quả và thảo luận 3.1.Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải Xenlulo từ phần chất xơ trong dạ dày bò. 3.2. ứng dụng vi khuẩn từ phần chất xơ vào quá trình phân huỷ rác thải. 3.3. Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải Xenlulo có trong nớc rác rò rỉ. 3.4. xác định khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ của vi khuẩn trong nớc rác rò ri. 3.5. Hớng nghiên cứu mới. Kết luận Tài liệu tham khảo 2 Mở đầu Môi trờng hiện nay đang trở thành vấn đề mang tính toàn cầu. Nó đòi hỏi phải có sự phối hợp chặt chẽ, lâu dài, sự đầu t hợp lý, đồng bộ nhằm giảm thiểu những ảnh hởng có hại gây sự suy thoái và huỷ hoại môi trờng. Cùng với sự phát triển của Khoa học- Công nghệ mức độ đô thị hoá ngày càng nhanh chóng, nhu cầu của con ngời cũng tăng rất nhanh trong những năm gần đây. Từ thực tiễn, do chất thải rắn chỉ đợc thu gom, mà không đợc phân loại và xử lý tại nguồn phát sinh nên đã gây ô nhiễm môi trờng ở tất cả các khâu: từ thu gom, lu giữ trong nhà, rơi vãi trên đờng phố trong vận chuyển đến ô nhiễm tại bãi rác. Nếu cứ giữ nguyên phơng thức thu gom xử lý chất thải rắn nh hiện nay thì quy mô bãi rác cứ ngày càng tăng, chi phí cho xây dựng các bãi chứa rác càng lớn. Vấn đề di chuyển, quy hoạch một bãi rác mới không phải là đơn giản. Chất thải rắn sinh hoạt là mối quan tâm không chỉ của các nhà quản lý, các nhà khoa học mà cả chính của ngời dân ở địa bàn sinh sống. Vấn đề đặt ra là cần có một phơng pháp xử lý rác thải phù hợp, tiện lợi, dễ tiến hành nhất, nhằm giữ gìn môi trờng cảnh quan đồng thời giảm thiểu mức độ ô nhiễm. Dựa trên quan điểm đó, với hớng cần phân loại rác thải để phục vụ cho mục đích phân huỷ bằng phơng pháp sinh học. Trong nội dung khoá luận này, chúng tôi tập trung nghiên cứu : Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng một số vi khuẩn có khả năng phân giải xenlulo, góp phần xử lý rác thải sinh hoạt 3 Tổng quan 1.1. Rác thải sinh hoạt 1.1.1. Nguồn gốc Rác thải sinh hoạt tạo ra từ các nguồn chủ yếu sau : - Từ các khu dân c. - Từ các trung tâm thơng mại. - Từ các cơ sở trờng học, công trình công cộng. - Từ dịch vụ đô thị, sân bay. - Từ các hoạt động xây dựng đô thị. - Từ các trạm xử lý nớc thải, đờng ống thoát nớc của thành phố. 1.1.2. Thành phần Rác thải sinh hoạt có thành phần rất phức tạp nh : - Những hợp chất vô cơ: kim loại, sành sứ, gạch ngói vỡ, đất đá. - Những hợp chất hữu cơ: các loại thực phẩm d thừa hoặc quá hạn sử dụng, xơng động vật, rau xanh, vỏ hoa quả, các loại tre gỗ, lông gà, lông vịt, vải sợi, giấy, xác động - thực vật, cao su, nhựa . - Những loại khác: các hợp chất dễ bay hơi, trong đó có những chất mang mùi nặng. 1.1.3. Phân loại Rác thải đợc đa vào môi trờng từ nhiều nguồn khác nhau. Dựa trên tính chất thành phần có thể chia rác thải sinh hoạt thành 3 nhóm sau: Nhóm 1 : Chất thải thực phẩm Đó là các loại thức ăn d thừa, hoa quả, rau xanh . Chất thải thực phẩm là những hợp chất hữu cơ, mang bản chất sinh học. Vì vậy, chúng rất dễ bị phân huỷ bằng con đờng sinh học. Quá trình phân huỷ của chúng tạo nên các mùi khó chịu của CO 2 , NH 3 , H 2 S đặc biệt trong thời tiết ẩm. Nhóm 2 : Chất thải từ hoạt động công nghiệp, xây dựng 4 Gồm các loại phế thải: đất đá, gạch ngói, bê tông, các vật liệu bằng kim loại, thuỷ tinh, chất dẻo. Đây là nhóm chất thải khó phân huỷ, bền vững theo thời gian. Trong đó, vật liệu bằng kim loại, thủy tinh, các loại chất dẻo có thể tái sử dụng thành vật liệu composit và một số dạng đặc biệt khác. Nhóm 3: Chất thải từ nông nghiệp Là những chất thải và mẩu thừa từ các hoạt động sản xuất nông nghiệp (trồng trọt, thu hoạch) các loại cây trồng, các phế thải từ quá trình chế biến sữa, của lò giết mổ . Nhóm này đợc tập kết cùng với nhóm 1 để xử lý bằng phơng pháp phân huỷ sinh học. 1.2. Vi sinh vật và vai trò của vi sinh vật trong các chu trình biến đổi chất 1.2.1. Vi sinh vật Vi sinh vật (Microbe, Microorganism) là các sinh vật rất nhỏ bé không thấy bằng mắt thờng. Chúng gồm: vi rút, vi khuẩn, vi nấm, một số động vật nguyên sinh và tảo. Trong tự nhiên, vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá các chất, chúng có khả năng rất lớn trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ. Chúng tham gia vào việc phân giải và biến các chất có hại thành các chất vô hại. Tuy nhiên khả năng hoạt động của chúng còn tuỳ thuộc vào yếu tố môi trờng: nồng độ của các hợp chất hữu cơ, các kim loại nặng có tính độc, các loại hoá chất độc hại khác, độ pH, điều kiện nhiệt độ, nồng độ oxy hoà tan . 1.2.2. Vai trò của vi sinh vật trong vòng tuần hoàn chuyển hoá nguyên tố cacbon Cacbon là nguyên tố rất phổ biến trong tự nhiên. Nó tham gia vào việc cấu thành những hợp chất có vai trò quan trọng đặc trng cho sự sống của con ngời và động vật. Các hợp chất của cacbon quan trọng tới mức ngời ta gọi hệ thống sống là hệ thống nền cacbon. Các hợp chất cacbon hữu cơ có mặt trong động - thực vật, vi sinh vật. Khi các sinh vật này chết đi để lại một lợng chất hữu cơ khổng lồ trên trái đất. Nhờ hoạt động của các nhóm vi sinh vật dị dỡng cacbon, các hợp chất hữu cơ này dần bị phân 5 huỷ đến sản phẩm cuối cùng là CO 2 , H 2 O. Thực vật và một số vi sinh vật tự dỡng quang năng sử dụng CO 2 , H 2 O trong quá trình quang hợp tổng hợp nên các hợp chất cacbon hữu cơ của thực vật. Động vật và con ngời sử dụng cacbon hữu cơ từ thực vật và động vật để tổng hợp nên những hợp chất cacbon hữu cơ đặc trng cho mình thông qua con đờng đồng hoá và dị hoá. Quá trình hô hấp của con ngời, động vật thải ra CO 2 . Sau khi chết xác động vật và ngời bị phân huỷ dới tác dụng của vi sinh vật Hình 1: Vi sinh vật trong chu trình chuyển hoá cacbon 1.2.2.1. Sự phân giải các hợp chất Gluxit Các hợp chất Gluxit là thành phần chủ yếu của các chất khô trong thực vật (rau quả, cây cối ). Đồng thời, nó còn là nguồn năng lợng cho các quá trình sống của thực vật. Khi thực vật (cây cối, rau quả ) chết đi để lại một lợng lớn các hợp chất Gluxit. Quá trình chuyển hoá các hợp chất Gluxit nh sau: I.2.2.1.1. Sự phân giải các hợp chất đờng Xenlulo và tinh bột bị phân giải tạo thành đờng đơn. Đờng đơn tiếp tục bị phân giải dới tác dụng của vi sinh vật theo con đờng lên men (etylic, lactic, butyric, focmic). Nhiều loài vi khuẩn kị khí và hiếu khí tuỳ tiện tham gia vào quá trình lên men. Saccharomyces cerevisae - một loại nấm men-là tác nhân lên men mạnh nhất, đợc sử dụng trong quá trình lên men rợu, bia. Phản ứng : 6 Cacbon thực vật Cacbon động vật CO 2 Chất hữu cơ trong đất S.cerevisae C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH+2CO 2 Quá trình lên men lactic dới tác dụng của vi khuẩn họ Lactobacteriaccae và Streptococcus lactics . Phản ứng : Lactobacteriaccae C 6 H 12 O 6 2CH 3 CHOCOOH Quá trình lên men Butyric thực hiện bởi chi vi khuẩn Clostridium . Ngoài ra, trong quá trình trao đổi chất nhóm vi sinh vật dị dỡng hiếu khí tham gia vào quá trình phân giải đờng Glucoza thành CO 2 , H 2 O. 1.2.2.1.2. Sự phân giải tinh bột Tinh bột (C 6 H 10 O 5 ) n là những hợp chất hydratcacbon cao phân tử. Tinh bột chiếm tỷ lệ lớn trong thực vật, dới dạng hạt tinh bột. Nhiều vi sinh vật tiết ra hệ enzym amylaza ( - amylaza, -amylaza, - amylaza) phân huỷ tinh bột thành những hợp chất đơn giản: đờng và các axit hữu cơ. Bảng 1: Một số vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột: Nấm Vi khuẩn Aspergillus awarmorii A.candidus A.niger Candida japonica Bacillus amyloliquefaciens B.subtilis B.coagulans Clotridium amyloliticum 1.2.2.1.3. Sự phân giải Xenlulo Xenlulo là thành phần của màng tế bào thực vật. Xenlulo có trong rau quả (vỏ hạt, vỏ tế bào, vỏ quả ). Thực vật khi chết để lại một lợng lớn xenlulo ở trong thân cây, cành lá rụng xuống Hàm lợng xenlulo trong xác thực vật thờng thay đổi trong khoảng 50-80%. Một phần khác do con ngời tạo ra ở dạng chất thải: rác, rơm rạ, giấy vụn, mùn ca, vỏ bào, Có thể tính toán rằng tổng lợng xenlulo trên trái đất vào khoảng 3500 tỉ tấn. Nếu nh không có quá trình phân giải xenlulo thì lợng chất này sẽ ngập tràn trên trái đất. 7 Trong tự nhiên có nhiều loài vi sinh vật - mang hệ enzym xenluloza ngoại bào - có khả năng phân hủy xenlulo.Việc vi sinh vật phân huỷ xenlulo có ý nghĩa rất lớn trong vòng tuần hoàn địa hoá, góp phần nâng cao độ phì nhiêu cho đất cũng nh vào việc tiêu hoá thức ăn ở các loài động vật nhai lại. Hệ vi sinh vật phân giải xenlulo khá phong phú bao gồm : nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn. Chúng bao gồm cả những hệ vi sinh hiếu khí và yếm khí. Do đó, quá trình phân huỷ xenlulo diễn ra theo hai con đờng hiếu khí và yếm khí. Phân giải xenlulo trong điều kiện hiếu khí. Một số vi sinh vật tham gia phân huỷ Xenlulo trong điều kiện hiếu khí: Nấm Xạ khuẩn Vi khuẩn Alternaria Aspergillus ustus a.candidus Botritis Chaetomiumglobosum C.thermophil Fusariumoxysporum Actinomyces Micromonospora Streptomyces Str.cellulosae Str.celluloflavus Acetobacter xylinum Achromobacter Pseudomonasflourescens Trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật này thực hiện phân huỷ xenlulo rất mạnh. Đặc biệt xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng phân giải xenlulo đợc ứng dụng trong quá trình phân huỷ rác thải sinh hoạt. Những xạ khuẩn này thuộc nhóm a nóng, sinh trởng, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 45- 50 C, rất thích hợp với quá trình ủ rác . Hai enzym chính tham gia phân huỷ xenlulo là xenlulaza C 1 và xenlulaza C x . enym xenlulaza C 1 tác động sơ bộ vào các phân tử xenlulo thiên nhiên và biến chúng thành những chuỗi xenlulo mạch thẳng. Sau đó, dới tác dụng của enzym xenlulaza C x , xenlulo bị phân huỷ thành xenlobiose (gồm 2 phân tử gluco). Loại đờng này có thể tan trong nớc, dới tác dụng của - glucosidase biến thành gluco. Phân giải xenlulo trong điều kiện yếm khí . 8 Ngoài các vi sinh vật hiếu khí còn một số vi sinh vật yếm khí cũng tham gia tích cực vào quá trình phân huỷ xenlulo. Clotridium thermocellum, Clotridium omelianskii tham gia phân huỷ xenlulo bằng con đờng lên men xenlulo. C.thermocellum là loài vi khuẩn có hoạt tính phân giải xenlulo đầu tiên đợc nghiên cứu và đợc phân lập từ phân ngựa. Đặc điểm của C.thermocellum : lúc còn non có hình que ngắn, khi trởng thành có hình uốn cong, kích thớc dài, bào tử sinh ra ở một đầu. Chúng phát triển tốt trong môi trờng có nguồn xenlulo hoặc xenlubiose, nguồn NH 4 + , nhiệt độ thích hợp 60-65C. Sản phẩm của quá trình lên men là : etanol, axit axetic, axit focmic, H 2 , CO 2 . Đặc biệt, còn một nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo rất mạnh trong điều kiện yếm khí là nhóm các vi sinh vật sống trong dạ cỏ của trâu, bò và các động vật nhai lại. Trong những nghiên cứu cho thấy: trong 1ml các chất lấy từ dạ cỏ của bò có khoảng 10 9 -10 10 tế bào vi khuẩn. Hệ vi khuẩn và động vật nguyên sinh ở dạ cỏ động vật nhai lại gồm rất nhiều loài có khả năng phân giải xenlulo : Bảng 3: Hệ vi khuẩn và động vật nguyên sinh trong dạ cỏ của động vật nhai lại. Hệ vi khuẩn Hệ động vật nguyên sinh Ruminococcus flaveciens Bacteroid succinogenes Clotridium cellobioparum Ophryoscolex Isotrich Nhờ có hệ vi sinh vật phong phú, số lợng lớn nh vậy nên giúp cho trâu bò và các động vật nhai lại có thể tiêu hoá đợc cỏ, rơm rạ, và các hợp chất xenlulo khác. Chính vì những điểm đặc biệt nh vậy. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú ý đến hệ vi sinh vật sống trong dạ cỏ của những loài động vật nhai lại nh : trâu, bò, ngựa. 1.2.2.1.4. Sự phân giải Xilan 9 Xilan (Hemixenlulo) có nhiều trong xác thực vật. Hemixenlulo cấu tạo bởi các đơn vị nhỏ là các gốc - Xylose. Trong rơm rạ và các cây khô Xilan chiếm 15- 20%, trong bã mía 30%, trong gỗ thông 7-12%. Nhiều vi sinh vật nh nấm mốc, nấm men, vi khuẩn tiết ra enzym Xilanaza có khả năng phân giải Xilan. 1.2.2.1.5. Sự phân giải Lignin Các hợp chất Lignin có trong gỗ chiếm 20-30%. Đơn vị cấu trúc của Lignin là các dẫn xuất phenylpropan. Trong đó có 69%C, 7%H, 24%O. Lignin có cấu tạo vô định hình không tan trong nớc và axit vô cơ. Chỉ với kiềm, bisunfit natri, H 2 SO 4 thì Lignin mới bị phân huỷ một phần và chuyển sang dạng hoà tan. Sự phân giải Lignin nhanh nhất và phổ biến nhất trong tự nhiên là các loại nấm. Các loại nấm này tiết ra enzym Phanerochaeto Chrysosporium phân huỷ hầu hết các thành phần của gỗ kể cả Lignin gồm 3 nhóm: - Nấm mục trắng: chủ yếu là Basidomyces và một số ascomycetes là nhóm phân huỷ Lignin hữu hiệu nhất. - Nấm mục nâu: gồm một số Basidomycetes tác dụng và tấn công vào polysacarit trong gỗ, Lignin không bị phân huỷ nhng bị biến tính. - Nấm mục mềm: gồm một số actinomyces xâm nhập vào thành thứ cấp của các tế bào gỗ trong điều kiện ẩm cao, các vi sinh vật làm mềm các tế bào gỗ, làm giảm đáng kể trọng lợng . Khả năng phân huỷ Lignin ở vi khuẩn thấp. Lignin bền vững ở điều kiện yếm khí, chúng chỉ bị phân huỷ ở điều kiện hiếu khí mạnh mẽ. Thông thờng, sự phân giải Lignin xảy ra khi đồng thời sử dụng các nguồn cacbon khác: glucose, xenlulo Riêng một mình Lignin thì vi sinh vật không thể sử dụng làm nguồn dinh dỡng đợc. Nói chung sự phân huỷ Lignin rất khó khăn. Điều này ảnh hởng rất lớn đến hiệu quả của quá trình xử lý ủ rác . 1.2.2.2. Sự phân giải các hợp chất Lipit Trong rác thải sinh hoạt ngoài những hợp chất Protein, Gluxit còn một phần khác là các hợp chất Lipit (este của Glixerin và các axit béo), các chất Sáp (este phức tạp của axit béo và rợu cao phân tử đơn chức). Sáp là lớp bao phủ bên ngoài của lá 10