Phân lập và xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển ở vùng biển hải phòng

639 TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG – LÂM – NGƢ ĐẶNG XUÂN MẠNH PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Ở VÙNG BIỂN HẢI PHỊNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN NGHỆ AN, NĂM 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG – LÂM – NGƢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Ở VÙNG BIỂN HẢI PHỊNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƢ NGÀNH NI TRỒNG THỦY SẢN Ngƣời thực : Đặng Xuân Mạnh Mã số sinh viên : 1153033173 Lớp : 52K – NTTS Ngƣời hƣớng dẫn : Th.S Lê Minh Hải Th.S Phạm Thị Tâm NGHỆ AN, NĂM 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh đặc biệt Th.S Lê Minh Hải, người hướng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội chia sẻ khó khăn, giúp tơi triển khai nội dung đề tài Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn thầy giáo, giáo, gia đình, bạn bè động viên nhiệt tình ủng hộ để tơi hồn thành khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn! ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI Broth : Brain Heart Infusion Broth CFU :Colony Forming Unit Ctv : Cộng tác viên D : Đường kính EDTA : Ethyllene diamine tetra acetic acid KIA : Kligler Iron Agar OD : Optical density UV : Ultrviolet light TCBS :Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose LB : Lubria – Bertani h : iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VIBRIO PARAHAEMOLITYCUS 1.1.1 Đặc điểm Vibrio parahaemolyticus 1.1.2 Các phương pháp kiểm tra có mặt V parahaemolyticus 1.1.3 Gen độc tố V parahaemolyticus 1.1.4 Cơ chế gây bệnh 1.1.5 Triệu chứng gây bệnh 1.2 Bệnh hoại tử gan thận cá biển 1.3 Lịch sử phát bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus 11 1.3.1 Trên giới 11 1.3.2 Ở Việt Nam 12 1.4.Tình hình ni trồng thủy hải sản 13 1.4.1.Trên giới 13 1.4.2.Ở Việt Nam 14 1.5 Cá biển 14 Chƣơng VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2.2 Mơi trường hố chất 17 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phương pháp thu mẫu cá bệnh: 19 2.4.2 Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng 19 iv 2.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn V Parahaemolyticus 19 2.4.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 19 2.4.3.2 Phương pháp nhuộm soi vi khuẩn 20 2.4.3.3 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn tuyển chọn 20 2.4.3.4 Phương pháp thử nghiệm phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 20 2.4.4 Phương pháp nghiên cứu tính kháng kháng sinh số chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập 21 2.4.5 Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh hoại tử gan thận cá biển vi khuẩn V parahaemolyticus 22 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 23 2.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.5.1 Thời gian 23 2.5.2 Địa điểm 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết phân lập vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh cá biển 24 3.2 Một số đặc tính sinh hóa V parahaemolyticus 29 3.3 Khả kháng kháng sinh 32 3.4 Khả gây bệnh cho cá mú chủng vi khuẩn phân lập 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các kháng nguyên V parahaemolyticus Bảng 2.1 Thiết bị dùng nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Các mẫu bệnh phẩm đặc điểm hình thái chủng Vibrio phân lập từ mẫu hải sản nghi nhiễm V parahaemolyticus 25 Bảng 3.2 Các đặc tính sinh hóa chủng V parahaemolyticus phân lập 30 Bảng 3.3 Khả kháng kháng sinh chủng V parahaemolyticus phân lập 33 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn V parahaemolyticus quan sát kính hiển vi điện tử Hình 1.2 Một số lồi cá mú nuôi chủ yếu 15 Hình 1.3 Một số lồi cá biển (cá hồng, cá chẽm, cá giò) 16 Hình 3.1 Biểu cá biển mắc bệnh hoại tử gan thận 24 Hình 3.2 Các khuẩn lạc vi khuẩn V parahaemolyticus môi trường thạch TCBS 28 Hình 3.3 Hình thái tế bào vi khuẩn V parahaemolyticus 29 Hình 3.4 Vi khuẩn V parahaemolyticus môi trường KIA 31 Hình 3.5 Vi khuẩn V parahaemolyticus thử Indole với thuốc thử Kovacs 31 Hình 3.6 Vi khuẩn V parahaemolyticus thử catalase 32 Hình 3.7 Kết thử khả gây dung huyết 32 Hình 3.8 Khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập 33 Hình 3.9 Hình ảnh cá chết sau gây nhiễm với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập 34 vii MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Phát triển biển hướng tất yếu nghành nuôi trồng thủy sản iệt Nam, công nghệ nuôi biển giai đoạn đầu phát triển Chính mà năm gần nghề nuôi biển nước ta đầu tư nghi n cứu tạo nhiều lồi cá tiềm cho phát triển ni biển xa bờ Hiện nay, đối tượng nuôi mô hình ni thủy sản Việt Nam phong phú Trong đó, mơ hình ni cá lồng ngày khẳng định vị trí Đây mơ hình áp dụng cho nhiều lồi cá có giá trị kinh tế cao Cá nuôi lồng phải chịu nhiều yếu tố gây stress phải thích nghi với môi trường sống mới, tập quán sinh sản kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ảnh hưởng Vì thế, cá ni lồng thường mắc số bệnh vi khuẩn virus gây Các lồi cá biển như: cá mú, cá giị, cá chẽm… có giá trị kinh tế cao, thịt cá thơm ngon bổ dưỡng n n người tiêu dùng nước ưa chuộng Tuy nhiên nghề cá ni phát triển kéo theo dịch bệnh ngày gia tăng Đáng lưu ý bệnh hoại tử gan thận cá biển vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra, làm thiệt hại không nhỏ đến người nuôi cá biển Bệnh hoại tử gan thận xuất hầu hết loài cá biển (cá mú, cá chẽm, cá giò, cá hồng, cá bớp…), đặc biệt cá ni lồng, xuất cá nước Khi vi khuẩn V parahaemolyticus xâm nhập vào thể cá biển, gây hoại tử nội quan cá, lở loét lớp biểu bì Gan thận bị hoại tử, gan từ màu xám nâu chuyển thành màu vàng, làm cho cá biển chết hàng loạt Bệnh thường xảy giai đoạn cá, tìm phương pháp phịng trị bệnh hạn chế tổn thất dịch bệnh gây cần thiết Từ tình hình dịch bệnh hoại tử gan thận ngày gia tăng tr n cá biển ni cần phải có nghiên đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn này, từ đưa biện pháp phịng trị bệnh hiệu Xuất phát từ thực trạng nêu trên, tiến hành đề tài: “Phân lập xác định đặc tính sinh học vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận số loài cá biển vùng biển Hải Phòng” làm sở ban đầu hướng đến việc phòng bệnh hoại tử gan thận cá biển Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu bệnh phẩm số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tử gan thận vùng biển Hải Phòng 2.2 Mục tiêu cụ thể - Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu bệnh phẩm số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) bị bệnh hoại tử gan thận -Xác định đặc tính sinh học điển hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus: đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa, khả gây bệnh, tính kháng kháng sinh Từ tạo sở khoa học cho việc phát bệnh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cá lựa chọn kháng sinh thích hợp điều trị bệnh Bảng 3.1 Các mẫu bệnh phẩm đặc điểm hình thái chủng Vibrio phân lập từ mẫu hải sản nghi nhiễm V parahaemolyticus STT Tên Đặc điểm chủng thu mẫu Địa điểm thu mẫu Số Đặc điểm hình thái lƣợng mẫu Cá mú:Thân nhạt màu, B20M2 dày khơng có thức ăn, Cát ruột khơng chất chứa, Bà, có Hải Phịng gan Khuẩn lạc màu xanh đậm, trịn, lồi, trơn bóng D = 4mm xung huyết Khuẩn lạc tròn, vàng A3.3 Nước nuôi cá mú Cát không vaccine Bà, đậm, trơn bóng Chuyển Hải Phịng vàng tồn mơi trường D = 0,8-1mm A2.5 A3.13 N9.2 Mang vây cá thu Mang vây cá giò Gan ruột cá hồng HH3.30 Cá cơm sống Đồng Khuẩn lạc màu vàng, Châu, Thái tròn, nhăn, bóng Bình D=1,2-1,5 mm Đồng Khuẩn lạc nhỏ, trịn, Châu, Thái bóng Bình D= 0,2 – 0,5 mm Đồng Khuẩn lạc màu xanh Châu, Thái đậm, trịn, lồi, bóng, D = Bình Hải Thịnh, Nam Định 25 3,5mm Khuẩn lạc có dạng rìa xanh tâm đen, trơn bóng, D = 0,5-1mm Nước nuôi cá HH3.34 hồng thu bè ni B13M1 B5M3 thu từ bè ni có dấu hiệu chóc vảy 10 11 A6.1 N13.1.1 B5M4 Nam Định Nam Định Hải Thịnh, Nam Định Đầu ruột cá Cát chẽm Hải Phòng tượng lở loét bớp: mang nhạt, ruột gan có tượng xung huyết Bà, Hải Phịng B5M2 đậm, trơn, bóng, D =3- 3,5mm Khuẩn lạc có màu xanh đậm mơi trường, lồi, trơn, bóng, D = 3-4mm Khuẩn lạc có màu xanh đậm mơi trường, lồi, trơn, bóng, D = 3mm tròn bong, D = 2-3mm Khuẩn lạc màu xanh đậm, trịn, lồi, bóng, D = 4mm Vịnh Lan Khuẩn lạc có màu xanh Hải đậm mơi trường, lồi, Hạ, Phịng trịn, bóng, D = 3mm Mang vây cá 13 Khuẩn lạc có màu xanh Bà, Khuẩn lạc vàng cam dẹt Da cá mú có Cát Cá 12 Hải Thịnh, Nước ni cá mú Hải Thịnh, Da cá giò, mú có tượng Cát Hải, bơi chậm, bơi gần Hải Phịng bè Khuẩn lạc có màu xanh đậm, trịn, trơn, bóng, D = 3,5mm Khuẩn lạc có màu xanh 14 A5.12 Cá thu sống Hải, nhạt mơi trường, Cát Hải Phịng trịn, bóng, lồi D = 0,51mm 26 Nước + rêu Vịnh Lan 15 A3.4 bè nuôi cá hồng Hạ, khơng có vaccine 16 17 18 19 N20.M N13.2.1 A3.4 B5M1 Cá chẽm chết, bị phân hủy tầng mặt Hải Phịng Châu, Tiền Thái Bình Cá cơm vừa đánh bắt Cá hồng: mang màu hồng tươi Đồng B5M5 có Khuẩn lạc màu vàng cam, dẹt, trịn, bóng, D = 1,5 -2mm Khuẩn lạc trắng đục lồi Đồng Khuẩn lạc hình trịn, nhỏ, Châu, Thái có màu vàng nhạt, trơn Bình Nam Định Nam Định tương xung huyết xanh, lồi nhỏ, D = 3mm gan cá vừa mổ Hải Thịnh, không màu Bình Cá hồng: ruột 20 tâm, viền ngồi Châu, Thái cao, trịn bóng to, D = Cá giị: chết Hải Thịnh, tầng mặt Khuẩn lạc xanh thẫm 1-1,5mm Đồng Hải, bóng, D = 1mm Khuẩn lạc màu xanh nhạt, bờ tròn đều, láng, D = 1,5mm Khuẩn lạc màu vàng, to, trơn láng, bờ tròn đều, D = 3-4mm Kết phân lập chủng Vibrio parahaemolyticus từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận thu thập vùng biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải, Hải Phòng; vùng biển Đồng Châu, Thái Bình; vùng biển Hải Thịnh, Nam Định ni cấy tr n môi trường chọn lọc TCBS thu 20 chủng vi khuẩn có kích thước khuẩn lạc đặc điểm hình thái khác (bảng 3.1) Một số chủng có vài đặc điểm tương tự nhau, chúng thuộc chung lồi Dựa theo khóa phân loại Bergy nghiên cứu Tetsuya cộng (1998), Fujino cộng 27 (1974), Zulkifli cộng (2009) mơ tả hình thái vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, ta chọn lọc chủng có đặc điểm sau: vi khuẩn phẩy khuẩn, khuẩn lạc hình trịn, bờ đều, lồi, bóng, có màu xanh xanh đậm môi trường khuẩn lạc có đường kính từ - 4mm (hình 3.2) Hình 3.2 Các khuẩn lạc vi khuẩn V parahaemolyticus môi trường thạch TCBS Sau chọn lọc chủng V parahaemolyticus có màu xanh đậm nuôi tr n môi trường thạch TCBS 24 giờ, tiến hành nhuộm Gram quan sát kính hiển vi, ta thấy vi khuẩn có màu hồng Fuchsin chứng tỏ vi khuẩn Gram âm Điều giải thích vi khuẩn Gram âm ngồi lớp peptidoglycan cịn có lớp màng ngồi phúc hợp lipidpolysaccharide (gồm lipoprotein lipopolysaccharide) có chất lipid Khi dùng cồn 960C, vi khuẩn gram dương lỗ peptidoglican co lại nên không bị tẩy màu không bị bắt màu thuốc nhuộm cịn gram âm cồn dễ dàng tẩy lớp lipid lớp peptidoglican mỏng nên gram âm bị màu tím Khi rửa cồn nên rửa nhanh để đủ tẩy lớp lipid, lớp peptidoglican bên bắt màu đỏ hồng lần nhuộm tiếp Nếu dùng cồn q lâu khơng bắt màu fuchsin lần sau Kết bảng cho thấy 08 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus mà chúng tơi phân lập có đặc điểm hình thái sinh hóa điển hình lồi Vibrio parahaemolyticus, cụ thể: trực khuẩn gram âm (hình 3.3), có khả di động nhờ tiên mao 28 Hình 3.3 Hình thái tế bào vi khuẩn V parahaemolyticus Trong bước nuôi cấy tiếp theo, chủng chọn lọc dùng để kiểm tra phản ứng sinh hóa khả l n men đường, khả sử dụng nguồn amino acid, khả dung huyết khả chịu muối để định danh vi khuẩn 3.2 Một số đặc tính sinh hóa V parahaemolyticus 08 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ 80 mẫu cá mú, cá hồng, cá giò, cá chẽm nghi mắc bệnh hoại tử gan thận thu thập vùng biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải, Hải Phịng; vùng biển Đồng Châu, Thái Bình; vùng biển Hải Thịnh, Nam Định: với biểu hiện: tượng mắt lồi mù mắt hay tượng lở loét, xuất huyết thể Giải phẫu cá có biểu bệnh tích: xuất huyết vùng gan thận Phân tích đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập, chúng tơi thấy có l n men đường glucose, không l n men đường lactose, không sinh H2S, không sinh gas, phản ứng catalase dương tính, sinh idol, KIA dương tính tạo dung huyết theo kiểu β Kết thể bảng 3.2 hình 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 29 Bảng 3.2 Các đặc tính sinh hóa chủng V parahaemolyticus phân lập Chủng KIA Catalase Indol B20M2 + A3.3 Dung Di động H2S huyết Glucose Lactose + + - + - Β - - - - - - - N9.2 + + + - + - Β A3.13 - - - - - - - A2.15 - - - - - - - HH3.34 + + + - + - Β A5.12 - - - - - - - B5M2 + + + - + - Β HH3.30 - - - - - - - A6.1 - - - - - - - A6.5 - - - - - - - LB.T6 - - - - - - - N20.M2 - - - - - - - A5.12 - - - - - - - A3.4 - - - - - - - B13M1 + + + - + - Β N13.1.1 + + + - + - Β A3.4 - - - - - - - B5M3 + + + - + - Β B5M4 + + + - + - Β Cơ chất Để đánh giá khả l n men glucose, lactose, khả sinh sinh H2S, sinh di động sử dụng môi trường chứa hai đường Kligler Iron Agar (KIA) Sự đổi màu phần thạch nghiêng cho ta kết khả l n men đường lactose, vi khuẩn sử dụng đường lactose nên thạch chuyển màu vàng, kết (+), đổi màu phần thạch đứng 30 cho kết khả l n men đường glucose: vi khuẩn V parahaemolyticus không lên men đường lactose mà l n men đường glucose Khả di động vi khuẩn đánh giá tượng vi khuẩn mọc lan khỏi đường cấy, cho ta kết dương tính Hình 3.4 Vi khuẩn V parahaemolyticus tr n môi trường KIA Phản ứng sinh indol đánh giá thuốc thử Kovacs Vi khuẩn V parahaemolyticus có khả sinh indol Vì vậy, ống phản ứng mơi trường xuất lớp màu hồng bề mặt Những vi khuẩn oxy hóa tryptophan thành sản phẩm chứa gốc indol tạo màu đỏ, giữ lại chủng dương tính với thuốc thử, tạo màu bề mặt môi trường hồng Hình 3.5 Vi khuẩn V parahaemolyticus thử Indole với thuốc thử Kovacs 31 Phản ứng catalase đánh giá dựa vào tượng sủi bọt nhỏ H2O2 vào vi khuẩn tạo khí O2 Vi khuẩn V parahaemolyticus cho phản ứng catalase dương tính Hình 3.6 Vi khuẩn V parahaemolyticus thử catalase Tr n mơi trường thạch máu có bổ sung máu cừu, sau ngày nuôi cấy, tr n đĩa thạch máu mọc lên khuẩn lạc màu trắng ngà, trịn bóng, tạo dung huyết theo kiểu β Hình 3.7 Kết thử khả gây dung huyết 3.3 Khả kháng kháng sinh Mục đích nghiên cứu khả kháng kháng sinh vi khuẩn V parahaemolyticus đưa nhìn tổng quan để đánh giá hiệu sử dụng kháng sinh điều trị bệnh cho cá, đồng thời có sở để lựa chọn kháng sinh điều trị bệnh hoại tử gan thận cá biển Với logic tiếp cận vậy, thí nghiệm này, đánh 32 giá khả kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập với loại kháng sinh sử dụng tr n động vật thủy sản là: ampicilin, gentamycin, norfloxacin, enrofloxacin, erythromycin Kết thử nghiệm kháng sinh thể bảng 3.6 hình 3.11 Bảng 3.3 Khả kháng kháng sinh chủng V parahaemolyticus phân lập T n chủng Ampicilin Gentamycin Norfloxacin 25 µg 30 µg 10 µg D D Enrofloxacin Erythromycin µg D 15 µg D D N13.3.1 R 15 R 18 I R R HH3-34 R R 24 S R 14 R N9.2 30 S 25 S R R 22 S B20M2 R R R R R B13M1 R R 18 I 23 S 12 R B5M3 R R 24 S 17 I 14 R B5M4 R 15 R 18 I 22 S R B5M2 R 15 R 18 I 16 I R (S: Nhạy (≥20 mm), I: Nhạy trung bình (15-19 mm), R: Kháng (