Phân lập và đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn trong dịch dạ cỏ bò nuôi tại công ty cổ phần th truemilk

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH  LÊ MINH THANH phân lập đánh giá hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn dịch cỏ bò nuôi công ty cổ phần th truemilk LUN VN THẠC SĨ SINH HỌC Nghệ An - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH  LÊ MINH THANH phân lập đánh giá hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn dịch cỏ bò nuôi công ty cổ phần th truemilk Chuyờn ngnh: Sinh hc thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Hoàng Vĩnh Phú Nghệ An - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các kết quả, số liệu trình bày luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Nghệ An, ngày tháng 10 năm 2015 Tác giả Lê Minh Thanh ii LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành Bộ môn Sinh học thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Vinh Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc đến thầy giáo hƣớng dẫn khoa học TS Hoàng Vĩnh Phú tận tâm giúp đỡ, hƣớng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Khoa Sinh học, Phòng đào tạo sau đại học tạo điều kiện cho học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo, nhân viên Công ty Cổ phần sữa TH True Milk, huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn thành viên gia đình, bạn bè giúp đỡ tơi suốt q trình làm luận văn Nghệ An, ngày …… tháng 10 năm 2015 Tác giả Lê Minh Thanh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU .1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 THÀNH PHẦN THỨC ĂN VÀ Q TRÌNH CHUYỂN HĨA THỨC ĂN CỦA BÒ SỮA 1.1.1 Thành phần thức ăn cho bò sữa 1.1.2 Quá trình chuyển hóa thức ăn bị sữa .3 1.1.2.1 Q trình tiêu hố thức ăn 1.1.2.2 Q trình tiêu hố thành phần thức ăn 1.2 CƠ CHẤT CỦA HỆ ENZYME CELLULASE 10 1.2.1 Cellulose 14 1.2.1.1 Khái niệm cấu trúc 14 1.2.1.2 Thành phần sinh khối thực vật 14 1.3 CELLULASE .14 1.3.1 Định nghĩa .14 1.3.2 Tính chất enzym cellulase 14 1.3.3 Cấu trúc enzym cellulase 14 1.3.4 Thành phần cellulase 14 1.3.5 Cơ chế thủy giải cellulose .14 1.3.6 Ứng dụng enzyme cellulase 14 1.3.7 Hệ thống cellulase không phức hợp 14 1.3.8 Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp 14 1.4 SƠ LƢỢC VỀ VI SINH VẬT PHÂN HỦY CELLOSE 14 1.4.1 Nấm mốc 14 1.4.2 Vi khuẩn sản xuất cellulase .15 iv 1.5 TỔNG QUAN VỀ CÔNG TY CỔ PHẦN TH TRUE MILK 17 1.5.1 Lịch sử hình thành phát triển 17 1.5.2 Thực trạng chăn ni bị sữa công ty THtruemilk 19 1.6 LỊCH SỬ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 20 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 20 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 25 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 28 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 28 2.3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Mẫu vật phƣơng pháp lấy mẫu 28 2.3.2 Hóa chất thiết bị 28 2.3.2.1 Hóa chất .28 2.3.2.2 Thiết bị 30 2.3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .30 2.3.3.1 Phân lập vi sinh vật có khả phân giải cellulose 30 2.3.3.2 Phƣơng pháp bảo quản giống vi khuẩn [63] 31 2.3.3.3 Đánh giá hoạt tính cellulase ngoại bào [2],[63] 31 2.3.3.4 Xác định hoạt độ cellulase dựa vào lƣợng đƣờng khử tạo thành theo phƣơng pháp DNS [64] .31 2.3.3.5 Bƣớc đầu thử nghiệm sử dụng dịch chiết enzyme thô từ chủng vi khuẩn .33 2.3.3.6 Định danh vi khuẩn phân lập đƣợc phƣơng pháp hóa sinh 34 2.3.4 Phân tích tƣơng quan hoạt tính cellulase với suất cho sữa cá thể bò 34 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu .34 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELLULASE TỪ DỊCH DCB 36 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn từ dịch DCB .36 3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme cellulase .38 3.1.2.1 Tuyển chọn lần 38 v 3.1.2.2 Tuyển chọn lần 41 3.2 BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT ENZYME THÔ TỪ BỐN CHỦNG VI KHUẨN .44 3.2.1 Thử nghiệm khả đƣờng hóa giấy in, giấy báo cũ 44 3.2.2 Thử nghiệm khả phân hủy rơm rạ làm phân bón 46 3.2.2.1 Theo dõi thay đổi số tiêu đống ủ 46 3.2.2.2 Đánh giá độ chín mẫu ủ 47 3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SỰ TƢƠNG QUAN GIỮA HOẠT TÍNH CELLULASE VỚI NĂNG SUẤT CHO SỮA CỦA CÁC CÁ THỂ BÒ NGHIÊN CỨU 49 3.4 ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP HÓA SINH .51 3.4.1 Hình thái học tế bào, phản ứng Gram, thông tin bào tử, tính di động sản phẩm catalase 51 3.4.2 Hơi axit béo alcohol 52 3.4.3 Sử dụng nguồn carbon 53 3.4.4 Kết nhận diện vi khuẩn .55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 KẾT LUẬN .57 KIẾN NGHỊ 58 DANH MỤC .59 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 vi DANH MỤC VIẾT TẮT Viết tắt TT Viết đầy đủ AXBBH Axit béo bay BGL β - Glucosidase CBD Carbonhydrate CBH Cellobiohydrolase hay Exoglucanase CBH I Exoglucanase I CBH II Exoglucanase II CEM Cellulose enzyme microbe CMC Carboxylmethyl cellulose CMCase Enzyme carboxymethyl cellulase 10 CP Cổ phần 11 Dhalo Đƣờng kính vịng sáng 12 DCB Dịch cỏ bò 13 DNS 3,5 Dinitrosalicylic acid 14 ĐC Đối chứng 15 EG Endoglucanase 16 EG I Endoglucanase I 17 EG II Endoglucanase II 18 EG III Endoglucanase III 19 EG IV Endoglucanase IV 20 EG V Endoglucanase V 21 HEC Hydroxylethyl cellulose 22 N Nito 23 NPP Nito phi protein 24 OD Opital density 25 U Unit 26 VCK Vật chất khô 27 VSV Vi sinh vật 28 w/v Khối lƣợng/thể tích vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc tính enzym β - glucosidase 14 Bảng 1.2 Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome 14 Bảng 2.1 Giá trị pH dung dịch đệm citrat 29 Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ 10 mẫu dịch DCB 36 Bảng 3.2 Khả thủy phân chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 38 Bảng 3.3 Mƣời chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme cellulase cao 41 Bảng 3.4 Hoạt tính cellulase (IU) chủng vi khuẩn qua 4, 5, 6, 42 Bảng 3.5 Khả đƣờng hóa (%) dịch chiết enzyme chủng vi khuẩn 45 Bảng 3.6 Một số tiêu theo dõi mẫu ủ 47 Bảng 3.7 Tỷ lệ hạt nảy mầm, trọng lƣợng tƣơi đậu xanh sau ngày trồng phân ủ từ rơm rạ 47 Bảng 3.8 Sự tƣơng quan hoạt tính cellulase với suất cho sữa cá thể bò nghiên cứu 49 Bảng 3.9 Hình thái học tế bào, phản ứng Gram, thơng tin bào tử, tính di động hoạt tính catalase bốn chủng vi khuẩn 51 Bảng 3.10 Các sản phẩm lên men bốn chủng vi khuẩn 52 Bảng 3.11 Khả sử dụng nguồn cacbohydrat chủng vi khuẩn 54 Bảng 3.12 Kết nhận diện bốn chủng vi khuẩn 56 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Q trình tiêu hố gluxit bị Hình 1.2 Quá trình phân giải lên men gluxit cỏ Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hoá hợp chất chứa nitơ gia súc nhai lại .6 Hình 1.4 Sơ đồ chuyển hoá lipit gia súc nhai lại Hình 1.5 Cấu trúc cellulose 14 Hình 1.6 Cấu trúc cellulose vách tế bào thực vật 14 Hình 1.7 Cấu trúc β - glucosidase với xoắn K (màu đỏ), xoắn β (màu vàng) nối β (màu xanh) 14 Hình 1.8 Các ngun tử Calcium có cellulase (β - Glucosidase) vị trí Glu 295 Glu 325 hai chuỗi A B 14 Hình 1.9 Cơ chế hoạt động hệ cellulase Trichoderma reesei 14 Hình 1.10 Hình dạng nấm mốc 14 Hình 1.11 Hình dạng vi khuẩn Bacillus 16 Hình 1.12 Hình dạng vi khuẩn Clostridium 17 Hình 1.13 Trang trại bị sữa TH True milk huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An 18 Hình 1.14 Bò sữa trang trại TH True Milk 19 Hình 1.15 Quá trình chế biến thức ăn cho bị sữa trang trại TH True Milk .20 Hình 3.1 Các khuẩn lạc vi khuẩn môi trƣờng CMC từ dịch cỏ bị 37 HÌnh 3.2 Vịng thủy phân CMC dòng vi khuẩn sau 48h ủ 46 Hình 3.3 Khả thủy phân chủng vi khuẩn 40 Hình 3.4 Đƣờng chuẩn glucose bƣớc sóng 540nm 42 Hình 3.5 Trọng lƣợng tƣơi đậu xanh sau ngày trồng phân ủ từ rơm rạ 48 Hình 3.6 Sự tƣơng quan hoạt tính cellulase với suất cho sữa cá thể bò nghiên cứu 50 52 Theo bảng 3.9 cho thấy: - Cả bốn chủng vi khuẩn không thấy bào tử, không di động, sản phẩm catalase - Có chủng vi khuẩn D6 D15 biểu thị phản ứng Gram đa dạng, chủng D13 phản ứng Gram +, chủng D5 phản ứng Gram - - Chủng D6 D15 có hình dạng coccus thon dài, chủng D13 có hình dạng coccus, chủng D5 có hình gậy với chiều dài < 1µm 3.4.2 Hơi axit béo alcohol Bốn chủng vi khuẩn tồn phát triển môi trƣờng chứa cellulose Sau ngày ủ, dịch cấy đƣợc lấy để phân tích sản phẩm lên men nhƣ axit béo (VFA) (acetic, formic, propionic, butyric, axit valeric) alcohol (etanol metanol) theo phƣơng pháp sắc khí Nồng độ axit alcohol đƣợc tạo chủng vi khuẩn phân lập đƣợc thể milimol/lít Axit đƣợc tạo nhiều milimol/lít đƣợc gọi sản phẩm chủ yếu trình lên men Bảng 3.10 Các sản phẩm lên men bốn chủng vi khuẩn Sản phẩm lên men Chủng vi Lớn Nhỏ khuẩn (>1 milimol/l) (