Phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học học của fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Phân lập đánh giá hoạt tính sinh học Fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu Việt Nam NGUYỄN NGỌC ANH Anh.nn202251M@sis.hust.edu.vn Ngành Kỹ thuật hóa học Giảng viên hướng dẫn: TS Hồ Đức Cường Chữ ký GVHD PGS Thành Thị Thu Thủy Viện: Kỹ thuật Hóa học Hà Nội, 09/2022 Chữ ký GVHD CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả: Nguyễn Ngọc Anh Đề tài luận văn: Phân lập đánh giá hoạt tính sinh học Fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu Việt Nam Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số HV: 20202251M Tác giả, tập thể Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 23/09/2022 với nội dung sau: STT Nội dung đề nghị chỉnh sửa Nội dung chỉnh sửa Loại bỏ trích dẫn tài liệu thảm Loại bỏ 04 tài liệu tham khảo khảo mục “Tóm tắt nội dung” trích dẫn mục “Tóm tắt nội dung” Rà soát, chỉnh sửa giảm bớt tài Rà soát giảm bớt số lượng liệu tham khảo TLTK từ 124 xuống 98 TLTK Bổ sung phổ GC, thay phổ Thay phổ chưa rõ nét, bổ chưa rõ nét sung phổ GC mẫu Ftđ (Phụ lục 3) Rà soát lại số liệu IC50 thử nghiệm Rà sốt hiệu đính bảng kết hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính (Bảng 4.5) Ngày 10 tháng 10 năm2022 Giảng viên hướng dẫn TS Hồ Đức Cường PGS Thành Thị Thu Thủy Tác giả Nguyễn Ngọc Anh CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS TS Vũ Đình Hồng SĐH.QT.BM11 Ban hành lần ngày 11/11/2014 Lời cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cán hướng dẫn khoa học TS Hồ Đức Cường PGS Thành Thị Thu Thủy Đây người thầy cho chia sẻ, hướng dẫn giúp đỡ q trình thực nhiệm vụ nghiên cứu Tơi xin cảm ơn Thầy, Cô môn: Công nghệ Hóa dược BVTV, Viện Kỹ thuật Hóa học, ĐH BKHN cán Trung tâm phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho sở vật chất, trang thiết bị thí nghiệm để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ nghiên cứu giao Sau cùng, xin gửi lời tri ân tới gia đình, bạn bè người thân động viên tinh thần, thời gian vật chất để tơi có động lực cơng việc học tập Tóm tắt nội dung luận văn Fucoidan sulfate polysaccharide có rong nâu với nhiều hoạt tính sinh học q báu nên ln thu hút quan tâm nghiên cứu nhà khoa học nước giới Nhiều năm gần đây, nhà khoa học hướng đến nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố cấu trúc như: trọng lượng phân tử, thành phần đường, liên kết glycoside, vị trí hàm lượng nhóm sulfate đến hoạt tính sinh học sulfate polysaccharide nói chung fucoidan nói riêng Tuy nhiên vấn đề chưa làm rõ cần tiếp tục nghiên cứu Với mục tiêu nghiên cứu phân lập đánh giá hoạt tính sinh học fucoidan nhằm đóng góp vào việc làm sáng tỏ mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính fucoidan, chúng tơi thực đề tài: “Phân lập đánh giá hoạt tính sinh học Fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu Việt Nam” với nội dung phương pháp nghiên cứu cụ thể sau:  Thu thập mẫu rong nâu Turbinaria decurrens B biển Kiên Giang  Chiết tách fucoidan từ loài rong theo phương pháp Bilan CS thu mẫu Ftđ Xác định cấu trúc mẫu Ftđ phương pháp IR, NMR, MS, GPC…  Nghiên cứu thực tạo mẫu fucoidan trọng lượng phân tử thấp (LMWF) cách thủy phân mẫu Ftđ acid HCl 0,1N với thời gian thủy phân khác thu mẫu M1 – M7 Trọng lượng phân tử (TLPT) mẫu Ftđ M1 – M7 xác định phương pháp GPC  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư người mẫu Ftđ M1 – M7 theo phương pháp Skekan CS Đánh giá ảnh hướng TLPT đến hoạt tính gây độc tế bào mẫu fucoidan Với mục tiêu nội dung nghiên cứu nêu trên, nhóm nghiên cứu lên kế hoạch thực tiến độ thu kết sau: Mẫu fucoidan Ftđ phân lập từ loài T decurrens B với hàm lượng 2,9% galactofucan với cấu trúc hóa học xác định Các mẫu LMWF (M1 – M7) có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư đại tràng người HT29 tốt mẫu tự nhiên Trong đó, mẫu M5 với thời gian thủy phân 30 phút TLPT 96.000 g/mol thể hoạt tính tốt cao 92,6% so với mẫu tự nhiên Ftđ Tiếp tục tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào mẫu M5 dòng tế bào ung thư tuyến giáp ung thư cổ tử cung người cho thấy mẫu M5 thể hoạt tính tốt dòng tế bào ung thư Các kết đạt được, lần khẳng định bổ sung thông tin cho nghiên cứu trước trọng lượng phân tử yếu tố cấu trúc ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính sinh học fucoidan Ngồi ra, kết góp phần định hướng cho việc sử dụng fucoidan phục vụ cho sống đặc biệt lĩnh vực Y– dược Học viên Nguyễn Ngọc Anh MỤC LỤC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rong biển 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển 1.1.2 Nguồn lợi từ rong biển 1.1.3 Phân loài rong biển 1.1.4 Một số ngành rong biển phổ biến 1.1.5 Giới thiệu rong nâu Turbinaria decurrens B 1.2 Tổng quan polysaccharide từ rong biển 1.2.1 Polysaccharide từ loài rong lục 1.2.2 Polysaccharide từ loài rong đỏ 11 1.2.3 Polysaccharide từ loài rong nâu 12 1.3 Fucoidan từ rong nâu 14 1.3.1 Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu 14 1.3.2 Thành phần cấu trúc fucoidan từ rong nâu 17 1.3.3 Hoạt tính sinh học fucoidan từ rong nâu 25 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3 Cơ sở lý thuyết phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp chiết 29 2.3.2 Chiết tách polysaccharide từ rong biển 30 2.3.3 Phương pháp tạo fucoidan trọng lượng phân tử thấp 31 2.3.4 Phương pháp GPC nghiên cứu cấu trúc polysaccharide 32 2.3.5 Phương pháp IR nghiên cứu cấu trúc polysaccharide 33 2.3.6 Phương pháp NMR nghiên cứu cấu trúc polysaccharide 34 2.3.7 Phương pháp phổ khối lượng nghiên cứu polysaccharide 36 2.3.8 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 37 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 39 3.1 Thu thập xử lý mẫu rong 39 3.2 Xác định thành phần có mẫu rong 39 3.2.1 Xác định độ ẩm 39 3.2.2 Xác định hàm lượng tro 40 3.2.3 Xác định hàm lượng protein thô 40 3.2.4 Xác định hàm lượng lipid thô 41 3.2.5 Xác định hàm lượng laminaran 42 3.2.6 Xác định hàm lượng acid alginic 42 3.3 Chiết tách tinh chế fucoidan từ rong nâu T decurrens B 43 3.4 Xác định thành phần hóa học fucoidan từ T decurrens B 45 3.4.1 Xác định thành phần đường 45 3.4.2 Xác định hàm lượng sulfate 45 3.4.2 Xác định hàm lượng acid uronic 46 3.5 Xác định cấu trúc fucoidan từ T decurrens B 46 3.5.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 46 3.5.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 46 3.5.3 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 46 3.6 Thủy phân tạo fucoidan trọng lượng phân từ thấp (LMWF) 46 3.7 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào mẫu Ftđ LMWF 47 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 4.1 Thành phần hóa học mẫu rong T decurrens B 48 4.2 Thành phần hóa học fucoidan từ rong nâu T decurrens B 48 4.3 Phân tích cấu trúc fucoidan (Ftđ) từ rong nâu T decurrens B 49 4.3.1 Phổ hồng ngoại (IR) 49 4.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 49 4.3.3 Phổ khối lượng ESI – MS/MS 51 4.4 Kết xác định TLPT mẫu Ftđ LMWF M1–M7 56 4.5 Kết đánh giá hoạt tính gây tốc tế bào ảnh hưởng TLPT đến hoạt tính gây độc tế bào fucoidan 57 4.6 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào mẫu M5 59 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Hướng phát triển tương lai 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 72 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các phương pháp chiết tách fucoidan thực 15 Bảng 1.2 Một số phương pháp chiết tách fucoidan 15 Bảng 1.3 Thành phần fucoidan từ rong nâu thuộc Fucales 20 Bảng 1.4 Thành phần fucoidan từ rong nâu thuộc Dictyotales 21 Bảng 1.5 Thành phần fucoidan từ rong nâu thuộc Laminariales 21 Bảng 1.6 Cấu trúc đặc trưng fucoidan phân lập từ số khác 24 Bảng 1.7 Cơ chế tác dụng fucoidan với khối u 27 Bảng 2.1 Một số tín hiệu phổ IR đặc trưng polysaccharide từ rong biển 33 Bảng 2.2 Độ chuyển dịch hóa học số monosaccharide D2O 36 Bảng 4.1 Kết phân tích thành phần hóa học mẫu rong (%) 48 Bảng 4.2 Kết phân tích thành phần hóa học mẫu Ftđ 49 Bảng 4.3 Sự phân mảnh mono oligosaccharide 52 Bảng 4.4 Kết sắc ký thẩm thấu Gel (GPC) 56 Bảng 4.5 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 57 Bảng 4.6 Kết TLPT hoạt tính mẫu Ftđ LMWF 58 Bảng 4.7 Kết hoạt tính gây độc tế bào mẫu M5 dòng TBUT 59 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh số loài rong nâu Hình 1.2 Hình ảnh số lồi rong đỏ Hình 1.3 Hình ảnh số lồi rong lục Hình 1.4 Hình ảnh số đặc điểm lồi T decurrens B Hình 1.5 Cấu trúc Ulvan từ rong lục 10 Hình 1.6 Cấu trúc số polysaccharide từ rong đỏ 12 Hình 1.7 Cấu trúc số polysaccharide từ rong nâu 13 Hình 1.8 Các monosaccharide thành phần cấu tạo fucoidan 17 Hình 1.9 Đồ thị thành phần fucoidan từ họ Fucaceae 18 Hình 1.10 Đồ thị thành phần fucoidan từ họ Sargassaceae 18 Hình 1.11 Đồ thị hàm lượng sulfate có fucoidan từ Dictyotales 19 Hình 4.1 Phổ IR mẫu Ftđ 49 Hình 4.2 Phổ 1H – NMR mẫu Ftđ 50 Hình 4.3 Phổ 13C – NMR mẫu Ftđ 50 Hình 4.4 Sự phân mảnh oligosaccharide 51 Hình 4.5 Phổ ESI – MS/MS mẫu Ftđ 52 Hình 4.6 Phổ ESI – MS/MS mẫu Ftđ phân mảnh m/z 243 53 Hình 4.7 Phổ ESI–MS/MS mẫu Ftđ phân mảnh m/z 389 54 Hình 4.8 Phổ ESI – MS/MS mẫu Ftđ phân mảnh m/z 491 54 Hình 4.9 Phổ đồ ESI – MS/MS mẫu Ftđ phân mảnh m/z 405 55 Hình 4.10 Cấu trúc hóa học mẫu Ftđ 56 Hình 4.11 Ảnh hưởng Tthủy phân tới trọng lượng phân tử 57 Hình 4.12 Đồ thị mối quan hệ TLPT tới hoạt tính 58 Hình 4.13 Hình ảnh so sánh tế bào ung thư sau xử lý 59 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết tinh chế fucoidan từ loài T decurrens B 44 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh 13 C-NMR H-NMR Carbon-13 resonance Diễn giải nuclear Proton nuclear resonance magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H COSY Correlated Spectroscopy DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ESI-MS Electrospray ionization spectrometry FAO Food and agriculture organization of the United Nations Gel permeation chromatography GPC Phổ COSY mass Phổ phun mù điện tử Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc Sắc ký thẩm thấu gel bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HMBC Heteronuclear coherence multiple HSQC Heteronuclear coherence single-quantum IR Infrared spectroscopy LA 3,6-L-anhydrogalactose Phổ hồng ngoại Fucoidan trọng lượng phân tử thấp LMWF MS Mass spectroscopy Phổ khối lượng Mw Molecular weight Trọng lượng phân tử MWCO Molecular weight cut-off NOESY Nuclear overhauser spectroscopy effect Phổ NOESY TBUT Tế bào ung thư TLPT Trọng lượng phân tử TLTK Tài liệu tham khảo WoRMS JIRCAS World Register of Marine Species Japan International Research Center for Agricultural Science Phụ lục Phổ IR mẫu Ftđ 98 Mẫu Ftđ 96 94 92 406.97cm-1 %T 90 88 2903.13 835.90cm-1 86 579.94cm-1 685.27 2943.30 84 2987.50 962.50 82 80 78 77 4000 1639.52cm-1 1139.29 1255.04cm-1 3434.50cm-1 3500 1426.53cm-1 3000 2500 2000 1500 1038.84 1056.19cm-1 1000 500 400 cm-1 73 Phụ lục Phổ IR mẫu M5 99 98 96 Mẫu M5 94 92 %T 90 821.46cm-1 88 598.64cm-1 86 2939.29 84 82 1621.20cm-1 80 1147.32 1424.64cm-1 78 4000 1061.40cm-1 3429.14cm-1 3500 3000 2500 2000 cm-1 74 1034.82 1258.62cm-1 1500 1000 500 400 Phụ lục Sắc ký đồ GC-FID xác định thành phần đường mẫu Ftđ 75 Phụ lục Phổ 1H – NMR mẫu Ftđ 76 77 Phụ lục Phổ 13C – NMR mẫu Ftđ 78 79 Phụ lục Phổ ESI – MS/MS mẫu Ftđ 80 81 Phụ lục Sắc đồ GPC mẫu Ftđ Mẫu Ftđ 82 Phụ lục Sắc đồ GPC mẫu M5 Mẫu M5 83 Phụ lục Cơng trình khoa học công bố khuôn khổ luận văn 84 85 86 87 ... sáng tỏ mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính fucoidan, chúng tơi thực đề tài: ? ?Phân lập đánh giá hoạt tính sinh học Fucoidan trọng lượng phân tử thấp từ rong nâu Việt Nam? ?? với nội dung phương pháp... trọng lượng phân tử thấp Trong nhiều năm gần đây, nghiên cứu làm rõ ảnh hưởng yếu tố cấu trúc tới hoạt tính sinh học fucoidan ra, yếu tố trọng lượng phân tử ảnh hưởng lớn hoạt tính sinh học fucoidan: ... Ascophyllum nodosum 1.3.3 Hoạt tính sinh học fucoidan từ rong nâu a Hoạt tính chống đơng tụ máu Fucoidan có nhiều hoạt tính sinh học q báu, hoạt tính chống đơng tụ máu fucoidan thu hút quan tâm