Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin AS 48 của vi khuẩn enterococcus faecium trong tế bào

Những đặc trưng khác của AS-48 như tính ổn định, bền nhiệt và tính tan tiêu biểu trong phạm vi pH rộng thích hợp với nhiều loại thực phẩm hứa hẹn là sự lùa chọn thay thế cho các chất bảo

Để khắc phục những hạn chế của các phương pháp bảo quản thực phẩm truyền thống (bảo quản theo phương pháp hóa học, vật lý), các nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu, ứng dụng chất bảo quản sinh học không độc hại gọi chung là bacteriocin Đây là các peptit có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt an toàn, không gây tác dụng phụ khi sử dụng do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease trong đường tiêu hóa ở người Nhiều bacteriocin đã được nghiên cứu nhưng hiện nay mới

có nisin và pediocin PA-1/AcH được thương mại hóa, sử dụng trong công nghệ thực phẩm dưới dạng bột Do đó, việc nghiên cứu và tìm ra các bacteriocin an toàn, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là rất cần thiết Enterocin là các bacteriocin

được tạo ra từ chi vi khuẩn Enterococcus rất phong phú và đa dạng, có những đặc

tính đáng quan tâm trong chế biến, bảo quản thực phẩm Điển hình là enterocin

AS-48 - mét bacteriocin cấu trúc dạng vòng, có phổ ức chế rộng cả vi khuẩn gram dương và gram âm Những đặc trưng khác của AS-48 như tính ổn định, bền nhiệt và tính tan tiêu biểu trong phạm vi pH rộng (thích hợp với nhiều loại thực phẩm) hứa hẹn là sự lùa chọn thay thế cho các chất bảo quản hóa học trong tương lai

Từ tính ưu việt của enterocin, đặc biệt là enterocin AS-48 trong bảo quản nhiều loại thực phẩm, các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm thu lượng lớn peptit

này với mong muốn sử dụng thành thương phẩm Vấn đề gặp phải là các chủng vi

khuẩn Enterococcus có khả năng sinh enterocin thường tiết ra độc tè Việc lên men

và thu hồi sản phẩm theo tiêu chuẩn sạch để có thể sử dụng trong thực phẩm gặp nhiều khó khăn và đạt hiệu suất thấp Do đó, việc tập trung nghiên cứu tạo enterocin tái tổ hợp không những khắc phục hạn chế trên mà còn chủ động được nguồn enterocin Enterocin AS-48 hoàn toàn có thể được tổng hợp bằng con đường tái tổ hợp khi biết trình tự ADN của gen mã hóa cho AS-48 mà không cần phải phân lập

từ các chủng tự nhiên Như vậy, enterocin AS-48 có thể được tổng hợp với hiệu

suất cao bằng con đường tái tổ hợp nhờ vi khuẩn E coli

Từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Tổng hợp và biểu hiện

gen mã hóa cho enterocin AS-48 của vi khuẩn Enterococcus faecium trong tế bào Escherichia coli ER2566” nhằm mục đích tổng hợp enterocin AS-48 tái tổ hợp

để ứng dụng làm chất bảo quản nông sản, thực phẩm sinh học Công trình này được thực hiện tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN

1.1.1 Giới thiệu chung

1.1.1.1 Ngộ độc thực phẩm

Mặc dù con người đã sử dụng những công nghệ bảo quản thùc phẩm mới và

an toàn (ví dụ: HACCP - hệ thống kiểm soát rủi ro về vệ sinh an toàn thực phẩm mang tính phòng ngõa) trong chế biến và bảo quản nhưng các ca ngộ độc thực phẩm vẫn không ngừng gia tăng Error! Reference source not found. Các hóa chất, kim loại nặng, ký sinh trùng, nấm, virus và vi khuẩn đều có thể gây ngộ độc thực phẩm Trong đó, vi khuẩn là nguyên nhân phổ biến nhất với hơn 90% các ca

ngộ độc thực phẩm hàng năm, chủ yếu do Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii và Escherichia coli O157:H7 6, Error! Reference source not found. Trường hợp nhẹ là những hậu quả về rối loạn tiêu hóa, mất cân bằng điện giải, kiệt sức, trường hợp nặng có thể dẫn đến tử vong nếu không chữa trị kịp thời, đúng cách Do đó, an toàn thực phẩm luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mỗi quốc gia mà trọng tâm là bảo quản thực phẩm phòng tránh các vi sinh vật gây bệnh 6 Theo uỷ ban Khoa học và Công nghệ Hoa Kỳ, ước tính hàng năm nước này có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây ra 5000 ca tử vong Thực phẩm chính là thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản và các sản phẩm sữa, tiêu tốn từ 6,5-34,9 tỷ đô la Error! Reference source not found. Các mầm bệnh thực phẩm như Listeria spp có khả năng chịu

nhiệt độ thấp và nồng độ muối cao, gây ra hơn 2500 vụ ngộ độc thực phẩm với 500

ca tử vong chỉ riêng ở Hoa Kỳ 12 Ở Việt Nam, hàng năm cũng có hàng nghìn ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn thất về sức khỏe và kinh tế Trong năm 2008, tính đến tháng 7, đã có 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 người mắc và 43 người đã bị tử

vong Bởi vậy, những chất bảo quản thực phẩm an toàn là vô cùng quan trọng 1,

12

Cùng với sự gia tăng nhu cầu về những thực phẩm tự nhiên và an toàn hơn, con người cần những công nghệ bảo quản mới để ngăn ngõa sự hư háng và nhiễm độc thực phẩm Các cách truyền thống đã được thay thế bởi những công nghệ mới, cải tiến như khử trùng nhẹ bằng nhiệt, giảm không khí, đóng gói chân không, áp suất thuỷ tĩnh cao, chiếu tia tử ngoại và sử dụng chất kháng khuẩn tự nhiên - các bacteriocin 6, Error! Reference source not found. Việc sử dụng bacteriocin một mình hoặc kết hợp với xử lý hoá lý và chất bảo quản hoá học có thể là biện pháp hiệu quả để đảm bảo hàm lượng dinh dưỡng của nguyên liệu thô và thực phẩm, kéo dài thời gian bảo quản, kìm hãm vi khuẩn làm háng, gây bệnh 2

1.1.1.2 Bacteriocin

Bacteriocin được Gratia phát hiện lần đầu tiên năm 1925 với tên là principe

V bắt nguồn từ một chủng E coli có khả năng chống lại các chủng E coli khác

trong cùng môi trường nuôi cấy Thuật ngữ “colicin” do Gratia và Fredericq đặt ra

năm 1946 Ngày nay, colicin được dùng cho protein kháng khuẩn từ các loài E coli

và có quan hệ gần với Enterobacteriaceae Error! Reference source not found. Năm 1953, Jacob và CS đã đặt tên cho các protein có hoạt tính kháng khuẩn đặc hiệu cao là bacteriocin

Thuật ngữ bacteriocin được giải thích đơn giản Tương tự “ase” sử dụng trong enzyme, tiếp tố “cin” dùng để biểu thị hoạt tính tạo bacteriocin Tiếp tố “cin” được viết thêm vào tên chi (hay đúng hơn là tên loài) Colicin được phân lập đầu

tiên từ E coli, monocins từ L monocytogenes, subtilin được tạo ra bởi Bacillus subtilis, staphylocin từ S aureus và nhiều loại khác Các chữ cái theo thứ tù tìm ra

được viết sau tên bacteriocin để phân biệt với bacteriocin duy nhất từ chủng khác

cùng loài Ví dụ, lactacin F là bacteriocin thứ 6 được tìm ra từ loài Lactobacilli

34

Trong tự nhiên, vi sinh vật có khả năng tạo ra các hợp chất khác nhau nhằm hạn chế hoặc chống lại các vi sinh vật khác 44, 60 Các hợp chất này được biết đến như kháng sinh, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp như axit lactic, các yếu tố phân giải như lysozym, các dạng exotoxin protein và bacteriocin Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp 69 Họ bacteriocin gồm các protein đa dạng về mặt kích thước, vi khuẩn đích, dạng hoạt động và cơ chế miễn dịch Hiện nay, có hàng trăm loại bacteriocin Những bacteriocin này được tìm thấy trong hầu hết các

vi khuẩn, gần đây còn tìm thấy trong vi khuẩn cổ - Archaea (gọi là các Archaeocin)

60

Nhiều nghiên cứu được tiến hành với bacteriocin trên các loài vi khuẩn khác

nhau cho thấy chúng được mã hóa bởi các gen trên plasmid (ví dô, Col plasmid trong E coli) Mét số được mã hóa bởi các gen nằm trên ADN hệ gen, như

plantaracin A và sakacina 674, trong khi có trường hợp được xác định trên các transposon như nisin 69

Vì cũng có hoạt tính kháng khuẩn nên trước đây, bacteriocin bị nhầm lẫn như là “các chất kháng sinh” Năm 1965, Reeves và CS đã tìm ra sự khác biệt của bacteriocin với các chất kháng sinh bởi đặc điểm đặc trưng: Bacteriocin có bản chất

là protein Chính sự khác biệt này đã tạo nên đặc tính ưu việt của bacteriocin trong ứng dụng bảo quản thực phẩm 34

Sù tranh luận nên được đặt vào bối cảnh khám phá ra nisin năm 1924, trước

cả penicillin và colicin Khi đó những chất kháng khuẩn protein bị xem là các chất kháng sinh Chất kháng sinh được tạo ra bởi một nhóm hạn chế vi sinh vật, là sản phẩm trao đổi chất bậc hai Các chất này không có chức năng rõ ràng trong sinh trưởng và sinh sản của bản thân vi khuẩn, được tiết dễ dàng ra khỏi tế bào 60 Khi khám phá ra trong cấu trúc nisin có chứa một số axit amin hiếm như de-hydroalanin, dehydrobuterin và cầu lanthion sulfur đơn, nisin không được xem là

một protein bởi riboxom không tạo những axit amin này (kÓ cả những chất tương đồng với nisin như subtilin và epidermin) Chỉ đến khi Hansen và CS (1990) phát hiện ra rằng, nisin thực tế được tạo ra bởi riboxom qua quá trình khử nước các axit amin và sự hình thành cầu lanthion diễn ra sau dịch mã, nisin mới được công nhận

là một bacteriocin Sự có mặt của các gen riêng rẽ trong tổng hợp bacteriocin xác nhận rằng chúng là protein peptit thực sự Như vậy, bacteriocin được phân biệt để tránh sự nhầm lẫn và liên quan tới chất kháng sinh y học - có thể gây dị ứng bị cấm

sử dụng trong thực phẩm đối với con người Đặc điểm khác biệt chính là: Bacteriocin được tổng hợp trong riboxom, không phải là các chất chuyển hóa Do

có bản chất protein (thử nghiệm với các enzyme phân giải protein như trypsin, chymotrypsin và pepsin) 4 nên bacteriocin không gây tác dụng phụ do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease trong đường tiêu hóa ở người Bacteriocin có phổ kháng

-khuẩn tương đối hẹp, được tiết vào môi trường để ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn hay bào tử, đôi khi tiêu diệt các vi khuẩn quan hệ gần gũi với chủng sản xuất

Các tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin Các bacteriocin có dạng hoạt động kháng khuẩn khác với kháng sinh Các đặc điểm trên được tổng kết trong bảng 1 12, Error! Reference source not found 

Bảng 1 Sù khác nhau giữa bacteriocin và kháng sinh

Dạng hoạt động Hầu hết qua sự hình thành lỗ nhưng đôi

khi cũng tác động lên sự tổng hợp sinh học thành tế bào

Màng tế bào hay các đích nội bào

Ảnh hưởng độc lên tế bào

nhân chuẩn

1.1.2 Phân loại bacteriocin

Có nhiều tiêu chuẩn phân loại bacteriocin: Theo đặc điểm cấu trúc, khối lượng phân tử, phổ kháng khuẩn, sinh vật sản xuất 56, 59 Riley và CS (2007)

đã chia bacteriocin thành hai nhóm lớn theo vi khuẩn gram dương và gram âm Bacteriocin của vi khuẩn gram dương phong phú và đa dạng hơn ở vi khuẩn gram

âm Chúng phân biệt với bacteriocin gram âm theo hai cơ sở Thứ nhất, quá trình tạo bacteriocin không cần sự giết chết bản thân nó như ở vi khuẩn gram âm Đây là

do cơ chế vận chuyển, giải phóng bacteriocin ở vi khuẩn gram dương Một số tham gia vào hệ thống vận chuyển đặc hiệu bacteriocin, trong khi một số khác tham gia vào con đường vận chuyển phô thuộc chuỗi tín hiệu (signal sequences dependent export pathway) Thứ hai, vi khuẩn gram dương tạo quá trình điều hòa đặc hiệu bacteriocin, trong khi các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm chỉ phụ thuộc vào hệ thống điều hòa của tế bào chủ 60

1.1.2.1 Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm

Các bacteriocin tạo ra từ vi khuẩn gram âm là những protein kích thước lớn

Hơn 30 loại bacteriocin từ E coli đã được xác định Tuy nhiên, đến nay các yếu tố

ảnh hưởng đến quá trình tạo bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng Những hiểu biết này rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các quần thể vi khuẩn trong môi trường tự nhiên mà còn để giải quyết vấn đề ứng dông 60

Đại diện tiêu biểu cho bacteriocin từ vi khuẩn gram âm là colicin với phổ kháng khuẩn hẹp và hoạt động thông qua tương tác với thụ thể đặc hiệu màng ngoài của tế bào đích Colicin có các cụm gen phân bố trên các plasmid và được sắp xếp thành gen colicin mã hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mã hóa cho protein chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn và bất hoạt protein gây độc) và gen phân giải mã hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng colicin thông qua phân giải tế bào chủ 12, 60 Sù tạo colicin được thông qua đơn

vị điều hòa SOS (SOS regulon - là một dạng phản ứng của vi khuẩn với sự hư hại

ADN, trong đó, các gen lexA và recA có vai trò chủ chốt giúp điều hòa chuỗi phản

ứng SOS) 35, 73 và do đó, nã được tạo ra chủ yếu dưới những điều kiện ức chế Colicin tiêu diệt vi khuẩn qua các cơ chế khác nhau, bằng cách ngăn chặn tổng hợp thành tế bào, tăng tính thấm của màng tế bào đích do sự hình thành lỗ hay hoạt hoá hoạt động của nuclease 60

Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram âm

Các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm được đặt tên theo chi, loài sản xuất,

như klebicin của Klebsiella pneumoniae hay theo loài như colicin của E coli, marcescin của Serratia marcescens, alveicins của Hafnia alvei và cloacins của Enterobacter cloacae) 60 Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm có thể được phân thành ba nhóm dùa vào kích thước: Nhóm 1 - Colicin kích thước lớn (25-80 kDa), nhóm 2 - Các microcin kích thước nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3 - Bacteriocin như phần đuôi của phage gồm các đơn vị lắp ghép peptit Trong đó, microcin là những peptit khối lượng phân tử thấp không cảm ứng SOS, có cấu trúc tương tự bacteriocin líp II của vi khuẩn gram dương, được tổng hợp trong pha cân bằng 42 Bacteriocin như đuôi phage là các nuclease và protease kháng vi khuẩn que, tiêu diệt tế bào nhạy cảm bởi sự khử cực màng Chúng là những phage thiếu sót hay có nguồn gốc từ phage với chức năng như bacteriocin Ví dô: Pyocin R2 (từ

Pseudomonas spp.) là một phần thừa của phage P2 trong khi pyocin F2 tương tự

như phage 60

1.1.2.2 Bacteriocin từ vi khuẩn gram dương

Nisin là đại điện được nghiên cứu sớm nhất trong các bacteriocin vi khuẩn

gram dương Đây là lantibiotic được tạo ra từ Lactococcus lactis spp gọi là “các

chất ức chế nhóm N” 59 Hầu hết bacteriocin từ vi khuẩn gram dương là các peptit nhá, mang điện dương, kỵ nước hay lưỡng tính và thường không có thụ thể nhận biết đặc hiệu trên màng tế bào (trừ một số trường hợp ngoại lệ) Các bacteriocin này khác nhau ở dạng giải phóng, vận chuyển trong tế bào và sự phân cắt trình tự dẫn đầu trong quá trình chế biến tạo phân tử trưởng thành 56, 60

Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram dương

Nhiều nhà khoa học phân loại bacteriocin từ vi khuẩn gram dương theo các líp có một số điểm khác nhau Dùa trên các kết quả của Klaenhammer et al 1993, Kemperman et al (2003a), Cotter et al (2005b) … bacteriocin từ vi khuẩn gram dương được chia thành bốn líp theo hình 1:

Hình 1 Sơ đồ phân loại các bacteriocin từ vi khuẩn gram dương

Bacte iocin từ vi khuẩn gram dương

Lớp II: các lantibiotic, Mr bé (<10 kDa)

non-Lớp I: các

lantibiotic

Lớp III: các protein Mr lớn (>10 kDa)

Lớp IV: các peptit vòng

AII: như SA-FF22

phân giải IIIa: các

lysin

Líp I - Các lantibiotic (từ lanthionin - chứa antibiotic) là các peptit bền

nhiệt, tác động lên cấu trúc màng (<5 kDa), chứa các axit amin hiếm, bị biến đổi sau dịch mã như lanthionin (Lan), -methyllanthion, -methyl lanthionin (MeLan), dehydroalanin và dehydrobutyrin Líp I còn được phân nhỏ hơn thành các lantibiotic loại A, B, C theo cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng khuẩn

 Lantibiotic loại A là các peptit có cấu trúc mạch thẳng kéo dài và

linh động Loại A được phân thành hai phân loại AI và AII dùa trên kích thước, sự tích điện và trình tự peptit dẫn đầu Ví dụ: nisin thuộc phân loại AI, streptococcin

A-FF22 (SA-FF22) tạo ra bởi S pyogenes chủng FF22 thuộc phân loại AII

 Lantibiotic loại B là các peptit có hình cầu và kém linh động so với

loại A, thường không mang điện hay mang điện âm ở pH trung tính Hoạt động kháng khuẩn dùa trên sự can thiệp những phản ứng enzyme thiết yếu của các tế bào nhạy cảm Mersacidin đại diện cho loại này là peptit gồm 20 axit amin

 Lantibiotic loại C là các lantibiotic đa thành phần, chủ yếu cấu tạo

gồm hai peptit biến đổi sau dịch mã Trong đó, mỗi peptit có một Ýt hay không có hoạt tính kháng khuẩn nhưng chúng có vai trò điều phối, nghĩa là chỉ khi kết hợp hai peptit mới tạo phân tử bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn Ví dụ lactacin 3147

từ Lactococcus lactis DP3147 gồm hai peptit LtnA1 và LtnA2 34

Líp II - Bacteriocin <10kDa gồm các bacteriocin peptit đa dạng về khối

lượng phân tử, bền nhiệt và chứa các axit amin thông thường (non-lantibiotic) Đây

là líp được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhất 60 Những peptit này được chia thành ba phân líp là:

 Phân líp IIa gồm các bacteriocin với cấu trúc tương tù nh- pediocin-

có một trình tự liên ứng đầu N của bacteriocin hoàn chỉnh - Xaa-Cys Phân líp này được tập trung nghiên cứu nhiều do hoạt tính diệt mầm bệnh

Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-L monocytogenes hiệu quả Ví dụ: pediocin PA-1, mét peptit 44 axit amin từ Pediococcus acidilactici 17

 Phân líp IIb là bacteriocin nhiều thành phần cũng tương tù nh- ở

lantibiotic loại C Ví dụ, lactococcin G từ L lactis Mặc dù rất hiếm gặp nhưng

cũng có những bacteriocin ba hay bốn thành phần Ví dụ : SLUSH -hemolysin từ

Staphylococcus lugdunensis, là bacteriocin ba peptit; aureocin A70 từ S aureus

gồm bốn peptit

 Phân líp IIc là các bacteriocin còn lại của líp này nh- bacteriocin tiết

ra bởi con đường phụ thuộc chuỗi tín hiệu Ví dô : Sakacin Q

Líp III - Bacteriocin kích thước lớn >10kDa là các protein không bền

nhiệt, trừ propionicin SM1 từ Propinonibacterium jensenii Do đó, lớp này Ýt được

ứng dụng trong thực phẩm 60 Có thể chia thành hai phân líp, đầu tiên là bacteriolysin (các enzyme bacteriolytic) tiêu diệt các chủng nhạy cảm bằng cách

phân giải tế bào, ví dụ : lysostaphin từ Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus Phân líp thứ hai là các protein kháng khuẩn không phân giải, phải

kể đến đầu tiên là helveticin J, mét bacteriocin 37 kDa từ Lactobacillus helveticus

Lớp IV - Các bacteriocin vòng là líp đặc biệt gồm các bacteriocin có cấu

tróc vòng (Bảng 2) Đây là các peptit được biến đổi sau dịch mã bằng liên kết cộng hoá trị nội phân tử tạo cấu trúc vòng cho peptit trưởng thành Đến nay, líp này gồm một số thành viên nh- enterocin AS-48, circularin A, gassericin A … được tổng kết

ở bảng 2 60, 63

Bảng 2 Các bacteriocin vòng tạo ra từ vi khuẩn gram dương

Bacteriocin Nguồn gốc Kích thước

70 - Dạng chuẩn và là bacteriocin vòng biết rõ nhất cả về

hóa sinh và di truyền

2 Gassericin A Lactobacillus

gasseri LA39

58 - Bacteriocin vòng đầu tiên được báo cáo chứa hỗn hợp

D và L-axit amin (ít nhất D-Ala)

3 Reutericin 6 Lactobacillus

reuteri LA6

58 - Trình tự axit amin bậc nhất tương tự như gassericin A

nhưng khác biệt ở phổ ức chế do thành phần thay đổi Ala (tỷ lệ của D-Ala:L-Ala)

D-4 Circularin A Clostridium

beijerinckii ATCC

25752

69 - Có quá trình cải biến sau dịch mã khác thường; locus

gen (cir) chứa các gen cùng nguồn gốc với các gen được tìm thấy trong locus của as-48

5 Butyrivibriocin

AR10

Butyrivibrio fibrisolvens AR10

58 - Bacteriocin vòng đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn

dạ cỏ, tương đồng 45% với gassericin A

6 Uberolysin Streptococcus

uberis 42

70 - Từ chi Streptococcus, đáng chó ý do tính không bền

nhiệt và chỉ phân giải các tế bào sinh trưởng nhanh

7 Acidocin B Lactobacillus

acidophilus M46

58 - Bacteriocin có trình tự tương tự gassericin A, gen mã

hóa (acdB) ở trên một plasmid của chủng sản xuất

8 Subtilosin A Bacillus subtilis 35 - Bacteriocin vòng mang điện âm, tác động lên cả vi

khuẩn gram dương và gram âm, đáng chú ý ở khả năng chống chịu các điều kiện ức chế

1.1.3 Ứng dụng của bacteriocin

Đối với vi sinh vật, bacteriocin là phương thức để cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống giữa các loài, giúp cân bằng sinh thái vi sinh vật 69 Đối với con người, bacteriocin còng có vai trò quan trọng Những ứng dụng tiềm năng của bacteriocin gồm:

1.1.3.1 Bảo quản sinh học thực phẩm

Trước đây bảo quản thực phẩm dùa trên việc sử dụng các chất phụ gia tổng hợp hóa học Điều này khiến người tiêu dùng lo ngại do những ảnh hưởng có hại đến sức khỏe Bảo quản sinh học thực phẩm với việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng (giống bảo vệ) hay các sản phẩm trao đổi của chúng (chất bảo quản sinh học)

để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn là giải pháp có nhiều tiềm năng 56 Ưu điểm của bacteriocin trong bảo quản sinh học thực phẩm là tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh

tế do hư háng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng như những

xử lý nhiệt khắt khe Bacteriocin giúp bảo quản giá trị dinh dưỡng và vitamin, cung cấp những thực phẩm mới (ít axit, hàm lượng muối thấp và hàm lượng nước cao)

thỏa mãn nhu cầu công nghiệp và người tiêu dùng Error! Reference source not found., 44 Mét xu hướng trong công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu là hạn chế sử dụng chất phụ gia và thành phần nhân tạo, hạn chế sự chế biến nhưng phải đảm bảo

an toàn, giữ nguyên chất lượng Những yêu cầu này có thể được đáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin 30, 34

Bacteriocin có các đặc điểm lý tưởng trong bảo quản sinh học thực phẩm Nhiều bacteriocin bền trong điều kiện nhiệt độ chế biến cao và hoạt động trong phạm vi pH rộng Các bacteriocin được xem là hợp chất an toàn do bị phân giải như những protein khác trong thức ăn 56 Bacteriocin không mùi, không màu, không

vị, ảnh hưởng không đáng kể lên khu hệ vi sinh vật đường ruột, có phổ kháng khuẩn tương đối rộng lên nhiều mầm bệnh và vi khuẩn gây háng thực phẩm 30 Mét sè bacteriocin cho thấy hiệu quả bổ trợ khi sử dụng phối hợp với các yếu tố kháng khuẩn khác như hợp chất phenolic tự nhiên cũng như những protein kháng khuẩn khác Sự kết hợp các bacteriocin khác nhau có thể giúp ngăn ngõa sự phát triển của những chủng kháng Ngoài ra, sự kết hợp bacteriocin với xử lý vật lý như áp suất cao hay xung điện trường giúp bảo quản thực phẩm hiệu quả hơn, nhất là đối với những dạng có khả năng sống sót cao như vi khuẩn sinh bào tử Tính hiệu quả của bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, thành phần thực phẩm và cấu trúc, cũng như vi khuẩn thực phẩm Thực phẩm phải được xem như là hệ sinh thái mà các tương tác vi khuẩn có thể ảnh hưởng lớn đến cân bằng vi sinh vật và sự phát triển những vi khuẩn có lợi hay gây hại Do đó, cần xác định hiệu quả của bacteriocin cho mỗi hệ thống thực phẩm 34

Các bacteriocin được sử dụng trong bảo quản sinh học thực phẩm dưới ba dạng chính: 12

- Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic - LAB: Lactic axit

bacteria) để tạo bacteriocin in situ Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh

trưởng và tạo bacteriocin trong sản phẩm là quyết định

- Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm

- Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin như là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm Error! Reference source not found.

Một lùa chọn mới hiện nay trên cơ sở dạng thứ hai là dùng màng polythen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm 12

1.1.3.2 Các sản phẩm chăm sóc sức khỏe

Do nisin có khả năng ức chế phổ rộng các vi khuẩn gram dương nên được sử dụng trong ngăn ngõa chứng viêm vú ở gia súc Hiện nay, mutacin từ cầu khuẩn

thuộc các chủng của Streptococcus mutans biến đổi di truyền được sử dụng trong

sản phẩm chăm sóc sức khỏe răng miệng như kem đánh răng, nước súc miệng để ức chế sâu răng và cao răng Bacteriocin có trong xà phòng, mỹ phẩm giúp loại trừ mụn, trứng cá 34, 52

Các bacteriocin gần đây cũng được ứng dụng trong lĩnh vực y tế Do vi sinh vật đang tăng dần tính kháng kháng sinh nên các liệu pháp trong điều trị chống lại bệnh nhiễm trùng sẽ trở nên vô hiệu Bacteriocin có thể là một giải pháp cho trình trạng này, giúp điều trị nhiễm trùng da cục bộ hay nhiễm trùng kháng đa thuốc 56 Chóng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn với ưu điểm: Sản phẩm tự nhiên,

từ “vi khuẩn tốt” và không có rủi ro nhiễm bệnh hay các vấn đề khác Các chủng probiotic và các chủng tạo bacteriocin có khả năng bảo vệ đường tiêu hóa chống lại

vi khuẩn gây bệnh 12, 34

1.1.3.3 Các giống khởi động

Giống khởi động (Starter cultures) là các sản phẩm công nghiệp mà bản thân

tế bào vi sinh vật được sử dụng làm nguyên liệu cấy Thông thường giống khởi động là hỗn hợp các loài vi sinh vật có vai trò tạo màu, tạo mùi thơm đặc trưng, làm giảm độ pH, ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn có hại trong thực phẩm Khi sử dụng như là một giống khởi động, chủng sinh bacteriocin phải thực hiện lên men tối

ưu, ngoài ra phải tạo lượng bacteriocin đủ khả năng bảo vệ Ở mét số trường hợp,

sự tạo bacteriocin có thể giúp tăng tính cạnh tranh và ổn định giống nhưng không được can thiệp đến chức năng của giống khởi động ban đầu Do đó, giống khởi động phải kháng với bacteriocin Chúng được tạo ra qua quá trình chọn lọc các thể đột biến kháng tự nhiên, bằng nuôi cấy phụ lặp lại với việc tăng nồng độ bacteriocin

để chọn lọc các giống thích nghi hay bằng biến đổi gen Ví dụ, sự nuôi cấy một

chủng Enterococcus sinh enterocin AS-48 như là giống đồng nuôi cấy kết hợp với

một giống khởi động thương mại trong sản xuất phomat không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của giống khởi động hay đặc tính hóa sinh của phomat tạo ra Đồng thời

bacteriocin được tạo ra trong phomat đủ đảm bảo ức chế Bacillus cereus Error! Reference source not found., 34

Kỹ thuật ADN tái tổ hợp đã tạo ra các giống khởi động tái tổ hợp chứa gen miễn dịch và gen tạo bacteriocin Các gen này nằm trên một đoạn ADN cụ thể, được cài vào vector nhân dòng và chuyển vào các giống khởi động Chúng có thể được đưa vào giống khởi động trong sữa và trong sản xuất các thực phẩm lên men

khác để ức chế sự sinh trưởng của mầm bệnh in situ và tăng thời hạn sử dụng; vào

nấm men để ức chế các vi khuẩn gây háng lactic 34

1.1.3.4 Các probiotic

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về probiotic tăng lên nhanh chóng Nhiều sản phẩm probiotic đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng các loại sản phẩm đa dạng như viên bọc, bột, sữa chua làm giàu và nhiều loại thực phẩm khác Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống Theo đó,

probiotic là: “Những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể một lượng đủ lớn sẽ tác động có lợi cho sức khỏe của vật chủ” Error! Reference source not found. Vi sinh vật sử dụng cho các sản phẩm probiotic là nấm men, vi khuẩn (đặc biệt là

nhóm LAB) Ví dô, Lactobacillus acidophilus là LAB lên men đồng hình được tìm

thấy trong đường tiêu hoá của người và động vật Chúng được bổ sung vào các sản

phẩm sữa lên men thương mại nh- sữa chua acidophilus Những vi khuẩn này có

ảnh hưởng tích cực lên sức khoẻ con người nhờ khả năng sinh bacteriocin - giúp ức

chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh Các bacteriocin từ L acidophilus và L gasseri có tác dụng kích thích hoạt động của hệ thống miễn dịch, bất hoạt các hợp

chất gây đột biến và ung thư tiềm năng, giảm cholesterol trong máu Probiotic từ LAB hiệu quả trong ngăn ngõa sự rối loạn đường ruột và điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân khác nhau Bacteriocin giúp vi sinh vật có lợi cạnh tranh với vi sinh vật bản xứ còng nh- hệ vi khuẩn đường ruột gây bệnh 31, 34

1.1.3.5 Các dấu chuẩn tạo vector tách dòng trong thực phẩm

Các gen kháng kháng sinh (kanamycin, erythromycin, tetracyclin,…) được

sử dụng phổ biến nh- là dấu chuẩn chọn lọc trong vector tách dòng Với mục đích khoa học, các gen kháng kháng sinh dùng là dấu chuẩn hữu hiệu cho chọn lọc những thể biến nạp 69, 73 Tuy nhiên, các dấu chuẩn này không được chấp nhận trong thao tác với giống khởi động bởi lo ngại chúng có thể truyền tính kháng kháng sinh vào hệ vi khuẩn đường ruột Do đó, các gen kháng bacteriocin có thể được sử dông nh- là dấu chuẩn chọn lọc thay thế, tạo vector tách dòng an toàn trong thực phẩm 34 Tương tù nh- dấu chuẩn chọn lọc kháng sinh, chúng có thể được truyền và chọn lọc trong tế bào nhạy cảm với các yếu tố chọn lọc (bacteriocin) hay thiếu khả năng chuyển hóa yếu tố sử dụng chọn lọc (khả năng sử dông hydrat cacbon) 69 Ví dụ, gen miễn dịch lafI kháng lactacin F dùng cho các chủng Lactobacillus - nhạy cảm với lactacin F Gen miễn dịch ltnI kháng lacticin 3147 từ

L lactis, gen kháng nisin 69, 73

Hình 2 Các ứng dụng của bacteriocin

1.1.4 Các bacteriocin thương mại

Những năm gần đây, mối quan tâm về tính an toàn và chất lượng của thực phẩm đã thôi thúc các nhà khoa học khám phá và phát triển phương pháp mới trong bảo quản thực phẩm, đặc biệt là các bacteriocin Tuy nhiên đến nay, tác dụng của các bacteriocin trong thực phẩm chủ yếu là trên thí nghiệm Có thể do yêu cầu khắt khe đối với một sản phẩm bảo quản sinh học an toàn còng nh- những quan điểm trái ngược về những giống khởi động cải biến di truyền trong thực phẩm Tuy nhiên, khi người tiêu dùng cần những sản phẩm được bảo quản, Ýt bị chế biến, việc

sử dụng bacteriocin có thể trở nên phổ biến hơn, nh- là một phương tiện giúp bảo quản thực phẩm “tự nhiên” 20 Dưới đây là một số tiêu chuẩn đặt ra cho sản phẩm bacteiocin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:

-Về tiêu chuẩn an toàn: Chủng sản xuất phải có dạng GRAS (Generally regarded as safe - được đánh giá là những vi sinh vật an toàn), phải được thử nghiệm tính độc, không có rủi ro về sức khỏe qua quá trình xác định các mặt như ảnh hưởng tích lũy, điều phối và tiềm tàng 69

Đườn tiêu h a của n ười

Ba teriocin LAB

T ực p ẩm

Thuốc chữa bệnh

An toàn và chất lượng thực phẩm

Tinh sạch

Chất phụ gia (Nisin)

Các probiotic

Giống khởi

động hay

đồng nuôi cấy

-Tính hiệu quả: Bacteriocin phải ức chế sự sinh trưởng lên phổ rộng các

mầm bệnh và vi khuẩn gây háng nh- L monocytogenes và C botulinum hay có hoạt

tính chống lại một mầm bệnh đặc hiệu Bacteriocin phải bền nhiệt và có hoạt tính cao khi kết hợp trong thực phẩm Tất nhiên, bacteriocin cũng không được ức chế sinh trưởng của các giống khởi động khác 12, 44

Hiện nay, chỉ có hai bacteriocin được thương mại là nisin từ Lactococcus lactis và pediocin PA-1/AcH từ Pediococcus acidilactici, chóng đều được sử dụng

trong công nghiệp thực phẩm Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thương mại tương ứng là NisaplinTM

, ALTATM12 Nisin được khám phá ra đầu tiên với mong muốn ứng dụng trong công nghệ trị liệu Tuy nhiên những nghiên cứu sau đó cho thấy nisin không bền ở pH sinh lý

và tính nhạy cảm cao với sự phân hủy của enzyme Với khả năng ức chế các mầm

bệnh (đặc biệt là L monocytogenes) giúp nisin phù hợp hơn trong công nghiệp thực

phẩm Nisin được thương mại đầu tiên ở Anh năm 1953 Ngày nay, nisin là một sản phẩm được FDA phê chuẩn, được WHO công nhận an toàn 69 và bán dưới dạng bột sấy khô - từ sữa tách bơ qua quá trình lên men Nisaplin được sử dông hơn 50 nước như là một chất phụ gia thực phẩm, chủ yếu trong chế biến phomat, sản phẩm sữa và thực phẩm đóng hộp 12

Pediocin PA-1 đã được thương mại và kiểm soát bởi một số hãng độc quyền Hoa Kỳ và Châu Âu Quá trình lên men tạo pediocin PA-1 đã sẵn sằng để thương mại và được sử dụng như là một chất bảo quản thực phẩm Error! Reference source not found.

Các bacteriocin khác như lacticin 3147, enterocin AS-48 hay variacin cũng

có nhiều triển vọng Trong khi đó, các bacteriocin phổ hẹp có thể được dùng trong

ức chế lùa chọn đặc hiệu cao với vi khuẩn gây hại nguy hiểm như L monocytogenes

34

1.2 ENTEROCIN

1.2.1 Enterocin

1.2.1.1 Giới thiệu enterocin

Đa số các chủng của Enterococci có khả năng tạo bacteriocin Chúng được

gọi là các enterocin hay enterococcin và hầu hết thuộc về líp II Hầu hết các

enterocin được tinh chế và xác định di truyền nhiều năm nay đều từ E faecalis và

E faecium 52 Điều thó vị là enterocin có khả năng chống lại các Enterococci khác, LAB, L monocytogenes, S aureus và Clostridium spp (gồm C botulinum, C perfringens và C tyrobutyricum) 57 Hoạt tính kháng Listeria có thể được giải thích bởi thực tế rằng Enterococci và Listeria có quan hệ gần về mặt phát sinh

Error! Reference source not found. Enterocin có tính bền với nhiệt độ cao và

sự dao động pH 26

Enterocin là các peptit nhỏ được tổng hợp trong riboxom, không bị biến đổi sau dịch mã, trừ việc phân cắt peptit dẫn đầu Những nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để xác định liệu enterocin được mã hóa bởi gen xác định trên ADN hệ gen hay ADN plasmid; xác định các đặc điểm của bacteriocin giúp cho việc tinh sạch, nhân dòng và biểu hiện gen thuận tiện 57

1.2.1.2 Phân loại enterocin

Các enterocin có thể được phân chia thành hai líp chính:

Líp I: Lantibiotic với duy nhất một đại diện là cytolysin hai peptit từ E faecalis 27 Đây là peptit duy nhất được phân lập từ Enterococci với hoạt tính

cytolytic (hemolytic-tiêu máu) Cytolysin là một yếu tố độc nên nã không được xem

là yếu tố kháng khuẩn Các gen mã hóa cho cytolysin được tìm thấy không chỉ trong

các chủng Enterococcus từ bệnh viện, người bệnh mà còn từ thực phẩm, động vật

42, 52

Líp II gồm các enterocin tương tự với bateriocin từ các chi LAB khác 23, là bacteriocin kích thước nhỏ, mang điện dương, kỵ nước, bền nhiệt Líp này có thể được chia thành các phân líp 27, 34:

Phân líp IIa - tương tự pediocin Chóng bao gồm enterocin A từ E faecium CTC 492, enterocin CCM 4231 từ E faecium CCM 4231, enterocin CRL35 từ E faecium CRL35 và mundticin từ E mundtii Nhiều loại E mundtii khác cũng tạo

bacteriocin nhưng cấu trúc của chúng chưa được xác định Những bacteriocin phân

líp IIa này có hoạt tính kháng khuẩn cao, điển hình là Listeria Đặc biệt, enterocin CRL35 có hoạt tính ức chế thậm chí cả virus Herpes simplex 18, 27

Phân líp IIb là các enterocin gồm hai chuỗi polypeptit Mét trong hai chuỗi

có hoạt tính nhưng cả hai chuỗi đều cần thiết trong sù tạo hoạt tính sinh học đầy đủ

27 Enterocin 1071A và 1071B từ E faecalis, enterocin L50A và L50B với hoạt

động điều phối Chúng không bị biến đổi sau dịch mã và không cần sự có mặt của một peptit tín hiệu cho quá trình tiết Error! Reference source not found., enterocin I (tương tự enterocin L50A)

Phân líp IIc gồm bacteriocin không thuộc các phân líp trên, như enterocin P

từ E faecium P13, bacteriocin 31 từ E faecalis tiết ra bởi con đường phụ thuộc

chuỗi tín hiệu, enterocin Q, enterocin M (một biến thể của enterocin P), enterocin B

Phân líp cuối cùng là bacteriocin vòng với đại diện enterocin AS-48, đây là

bacteriocin đầu tiên được tinh sạch từ chi Enterococcus 27, 42, 52, 57, 67

1.2.2 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp enterocin: Enterococci

1.2.2.1 Enterococci

Enterococci lần đầu tiên được miêu tả bởi Thiercelin năm 1899, là một chi

lớn thuộc họ LAB 12, 23 Enterococci gồm các cầu khuẩn gram dương, kỵ khí tùy

tiện, thường tồn tại dưới dạng cặp và chuỗi, lên men đồng hình và tạo L(+)LA (axit lactic đồng phân hình học dạng L) Đây là quá trình lên men hydrat cacbon thành axit lactic như là sản phẩm cuối cùng duy nhất, phân biệt với lên men dị hình (axit lactic là sản phẩm chính, ngoài ra còn các sản phẩm phụ như axit axetic, ethanol,

CO2, format hay succinat) 12, 59, 67 Enterococci phân bố rất rộng rãi, được tìm

thấy trong không khí, nước, chất thải, đất, thực vật Enterococci có nguồn gốc từ

đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng 42

Nguyên nhân chính giải thích cho sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên của

Enterococci so với các LAB khác đó là sự sống bền bỉ và chống chịu tốt trong các

môi trường đa dạng, các yếu tố ức chế sinh trưởng như axit, muối, khô hạn, nhiệt và các yếu tố hóa học Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 10-45oC, sống sót ở nhiệt độ 62,8oC trong 30 phót, nồng độ 6,5% NaCl và 40% muối mật, sinh trưởng ở pH 4,0-9,6, do đó cạnh tranh hiệu quả về dinh dưỡng và không gian sống 23, 42

Trong thời gian dài, sự có mặt của Enterococci trong thực phẩm bị xem như

là một chỉ thị của sự vệ sinh kém Nhưng ngày nay, Enterococci được xem như bình

thường trong hệ vi khuẩn thực phẩm bởi chúng có vai trò quan trọng giúp làm chín

và tạo mùi vị trong các thực phẩm lên men 42 Sù phân bố đa dạng và hoạt động

của Enterococci đã kích thích nghiên cứu của các nhà khoa học Nhiều nghiên cứu

gần đây đã tập trung vào sự xác định chi tiết và mô tả nhóm thó vị này của vi sinh vật 42, 61

Sự xác định Enterococci có thể được tiến hành bằng cách sử dụng các thử

nghiệm sinh lý Tuy nhiên, một số chủng với các đặc điểm không điển hình có thể

bị nhầm lẫn ở mức độ loài, thậm chí ở mức độ chi với Lactococci hay Vagococcus fluvialis Do đó, các phương pháp di truyền là cần thiết để xác định tin cậy những thành viên của chi Enterococcus 23, như nghiên cứu lai ADN: ADN và sự tương đồng trình tự gen rARN 16S Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được hơn 26

loài Enterococcus, phân thành 8 nhóm loài dùa trên quan hệ phát sinh loài (tổng

hợp ở bảng 3) [Error! Reference source not found., 44] Trong đó, E faecalis và

E faecium là hai loài chiếm ưu thế, có vai trò quan trọng trong vi sinh y học và thực

phẩm 23, 42, 44]

Bảng 3 Các “nhóm loài” khác nhau của Enterococci hiện nay và các loài dùa

trên quan hệ phát sinh chủng loại

1 E faecium ‘E azikeevi' (loài mới), E durans, E faecium, E hirae, E mundtii, E

porcinus, E villorum

2 E avium E avium, E malodoratus, E pseudoavium, E raffinosus

3 E gallinarum E casseliflavus, E flavescens (ít gặp), E gallinarum

4 E dispar E asini, E dispar (ít gặp)

5 E saccharolyticus E saccharolyticus, E sulfureus (ít gặp)

6 E cecorum E cecorum, E columbae (ít gặp)

7 E faecalis E faecalis, E haemoperoxidus, E moraviensis, 'E rottae' (loài mới)

8 Tetragenococcus E solitarius, Tetragenococcus halophilus, Tetragenococcus muriaticus

1.2.2.2 Vai trò của Enterococci

Enterococci có ý nghĩa lớn trong vi sinh vật học môi trường, thực phẩm và y

học Chúng giữ vai trò quan trọng trong quá trình chín, tạo kết cấu và mùi vị một loạt thực phẩm lên men truyền thống ở Châu Âu như phomat, xúc xích 42 Các

chủng của Enterococcus được sử dụng trong probiotic cho người và động vật ở một

số nước 12, tăng cường giá trị dinh dưỡng thực phẩm 42 Enterococci tạo ra một

loạt các bacteriocin khác nhau, một số chủng thậm chí có khả năng tạo ra nhiều bacteriocin 23 Dùa trên những nghiên cứu và theo hoạt tính kháng Listeria spp

mạnh, ứng dụng tiềm năng trong bảo quản thực phẩm sử dụng bacteriocin từ

Enterococci là rất hứa hẹn Error! Reference source not found.

Tuy nhiên, cũng có rủi ro khi sử dông Enterococci, đó là việc chúng có thể

gây háng thực phẩm (chủ yếu là các sản phẩm thịt), chỉ thị của sự kém vệ sinh 50,

61 Mét vài chủng Enterococcus có thể gây bệnh cho người như viêm màng trong

tim, nhiễm trùng đường tiết niệu 23 Mét nguyên nhân đáng chú ý là tính kháng

của chúng với kháng sinh 10, 29 Đặc biệt là các chủng kháng vancomycin, gây ra một loạt nguy hiểm và khó khăn trong điều trị bệnh nhiễm trùng 12, 23, 50 Những nghiên cứu gần đây cho thấy một số loài trong phân lập thức ăn có thể chứa

các yếu tố độc Trong đó, E faecalis chứa nhiều rủi ro tiềm Èn hơn và với tần suất cao hơn các chủng E faecium Sù truyền các yếu tố độc mã hóa trên plasmid đáp ứng pheromon có thể diễn ra in vitro hay trong đường tiêu hóa (với các nghiên cứu

trên mô hình động vật) Nhiều tính độc khác có mặt trong ADN hệ gen hay transposon 23, 40

Câu hỏi đặt ra về tính an toàn, có thể chấp nhận enterocin trong thực phẩm

và probiotic vẫn được tranh luận nhiều 23 Việc sử dông Enterococci như là các probiotic cần được nghiên cứu kỹ lưỡng Mỗi chủng của Enterococci nên được

kiểm tra tách biệt và chỉ cho phép ứng dụng trong thực phẩm nếu không chứa các yếu tố độc và kháng kháng sinh 12, 61 Cần nhấn mạnh rằng: Một số chủng

Enterococcus đã được công nhận với lịch sử lâu dài về tính an toàn Ví dô, E faecium SF68 đã được nghiên cứu hơn 20 năm cho việc sử dụng như một probiotic

ở người, đặc biệt trong điều trị tiêu chảy và được xem như một lùa chọn thay thế các kháng sinh Error! Reference source not found. Hơn nữa, vai trò và lợi Ých

cụ thể của Enterococci trong thực phẩm xứng đáng được tập trung nghiên cứu 23,

29, 42

1.3 ENTEROCIN AS-48

Enterocin AS-48 đã được nghiên cứu hơn 20 năm qua, là peptit kháng khuẩn

dạng vòng, được phân lập đầu tiên từ E faecalis subsp liquefacies chủng S-48

Chính cấu trúc vòng nội phân tử này tạo nên hoạt tính sinh học ưu việt của AS-48

so với các enterocin khác Enterocin AS-48 có hoạt tính kháng khuẩn rộng gồm vi khuẩn gram dương và gram âm 44, 60 Trong đó, các vi khuẩn gram âm nh- E coli, Myxococcus spp., Agrobacterium spp., Salmonella cholerasuis và Shigella sonnei bị ức chế ở nồng độ bacteriocin cao hơn so với các vi khuẩn gram dương gây

bệnh do ảnh hưởng bảo vệ của màng ngoài tế bào Error! Reference source not

found. Đến nay, chưa có bacteriocin nào khác từ LAB được biết có phổ ức chế rộng nh- thế AS-48 còn có đặc tính bền trong khoảng rộng pH và nhiệt độ, nhạy cảm với protease Do đó, enterocin AS-48 hứa hẹn cho những ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực bảo quản sinh học thực phẩm 63 Ngoài ra, enterocin AS-

48 còn được sử dụng nhiều trong nghiên cứu tương tác protein - màng 4 Đến nay, AS-48 là bacteriocin vòng được nghiên cứu rộng rãi nhất về đặc tính hoá sinh và di truyền 60

Các nhà khoa học đã tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật dùa vào PCR trên 15

chủng Enterococcus sinh bacteriocin, kết quả cho thấy sự tương tự của gen cấu trúc với gen mã hóa cho AS-48 Kết quả đạt được là 8 trên 10 chủng E faecalis và 3 trên 5 chủng E faecium nghiên cứu tạo enterocin tương tự với AS-48 52 Ví dụ, một vài biến thể tự nhiên của AS-48 có tên enterocin EFS2, enterocin 4 và enterocin

21 đã được tìm thấy trong nhiều chủng E faecalis còng nh- ở E faecium 7C5 Gần

đây, một biến thể của AS-48 (enterocin vòng AS-48RJ) với thay sù thay thế mét axit amin Glu20 bằng Val20 đã được phân lập từ chủng E faecium RJ16 Đa số các cụm gen as-48 được miêu tả xác định trên plasmid trừ AS-48RJ từ E faecium RJ16

là trên ADN hệ gen Error! Reference source not found., 46, 63

48 chứa hai protein vận chuyển ABC (ATP-binding cassette transporter) được mã hóa bởi as-48C 1 D và as-48EFGH, cùng được phiên mã trong mét mARN polycistronic với as-48D 1 Ba gen as-48BC 1 D tạo các protein chịu trách nhiệm

trong quá trình hoàn thiện và tiết của AS-48, bao gồm: Protein vận chuyển

As-48C1D và protein As-48B Trong khi As-48C1D có khả năng tạo tính miễn dịch ở mức thấp, As-48B có thể một mình hay phối hợp với As-48C1D (tạo protein đa thành phần As-48BC1D) giúp loại bỏ peptit dẫn đầu, thúc đẩy sự tạo vòng đầu - đuôi đồng thời với việc vận chuyển phân tử AS-48 trưởng thành ra ngoài màng tế bào 62, 63

Các gen as-48D 1 EFGH có vai trò tự bảo vệ tế bào sản xuất hay miễn dịch

60 Trong đó, As-48EFGH (protein vận chuyển thứ hai) - tham gia trong quá trình

tự bảo vệ chống lại AS-48 ngoại sinh, chóng hoạt động theo cơ chế miễn dịch bổ

trợ Gen as-48D 1 mã hóa cho mét peptit nhỏ kỵ nước, mang điện dương tạo tính kháng bacteriocin sinh ra, được xác định như quyết định tính miễn dịch 23 Đặc

điểm và vai trò cụ thể của các gen trong côm gen as-48 được tổng kết chi tiết trong

bảng 4

Bảng 4 Đặc điểm của các protein trong côm gen as-48

as-48H 399 Protein màng đầy đủ (4 TM) Transporter ABC miễn dịch

TM: các vùng vận chuyển màng

Hình 3 Sơ đồ cấu trúc plasmid pMB2

1.3.2 Đặc điểm cấu tróc

Enterocin AS-48 có cấu trúc phân tử gồm 70 axit amin (khối lượng phân tử

là 7,1 kDa) trong đó tỷ lệ các axit amin dạng axit kỵ nước chiếm 49% Các axit amin đều không chứa gốc lanthionin, -methyllanthionin và dehydrat nên khác biệt với nhóm lantibiotic 33, 63

Hình 4 Cấu trúc bậc hai của enterocin AS-48

Dùa trên phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân - NMR, cÊu trúc đơn phân của AS-48 gồm năm chuỗi xoắn kép  liên kết với nhau bởi các vùng nối ngắn, vòng xung quanh một cấu trúc rất vững chắc - lõi kị nước tạo thành một cuộn hình cầu 63 Năm chuỗi xoắn kép  từ H1 đến H5 lần lượt là Ala9-Ala21 (1), Val25-Ala34 (2), Ser37-Ala45 (3), Ile51-Lys62 (4) và Lys64-Phe5 (5) H1, H2 và H3tạo nên bề mặt kỵ nước bên ngoài cho phân tử AS-48 63 Điều thó vị là sự tạo vòng diễn ra với liên kết đầu - đuôi (giữa Met1 và Trp70) trong vùng xoắn H5, chứng

tỏ rằng cấu trúc của phân tử trưởng thành khác rất nhiều so với peptit bậc mét, giúp cho tính bền nhiệt (nhiệt độ biến tính là 102oC) và ổn định cấu trúc không gian phân

tử 33, 46, 60 AS-48 có 14 gốc mang điện (8 Lys, 2 Arg và 4 Glu) giúp phân tử mang điện dương mạnh (pI 10,5) Các gốc này chủ yếu nằm trong H4 và trong vùng nối giữa H4 và H5, ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng khuẩn, bằng cách thúc đẩy quá trình hình thành lỗ trên màng tế bào 33 Tổng điện thế dương tăng cao (từ +6 lên +10) tại pH 3 giúp cho sự ổn định dạng monomer trong dung dịch 63, 64

Đáng chó ý là năm chuỗi xoắn kép của enterocin AS-48 giống với NK-lysin kháng khuẩn động vật, một polypeptit của các tế bào T và tế bào chết tự nhiên NK-lysin là protein không vòng, mang điện dương, có năm chuỗi xoắn kép  được ổn định bởi cầu disulfur 60 trong khi bacteriocin AS-48 không có bất kỳ cầu disulfit nào nhưng lại ổn định cấu trúc không gian bằng cấu trúc vòng Chính những nét tương tự này đã góp phần quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc phân tử và cơ chế kháng khuẩn của enterocin AS-48 33

Hoạt tính của AS-48 phụ thuộc pH và trạng thái oligomer hóa của protein Mức độ liên kết của enterocin AS-48 trong dung dịch khác nhau tùy theo môi trường hóa lý 64 AS-48 ở dạng nhị phân (dimeric) từ pH 4,5 đến 8,5 (khối lượng phân tử trung bình là 15,50 kDa; 14,29 kDa; 15,10 kDa tương ứng ở pH 4,5; 7,5 và 8,5) Dạng nhị phân bền vững ở những giá trị pH này - Ýt nhất là 10-8M-1 Do đã, ở nồng độ sinh lý của protein, AS-48 gần như có cấu trúc nhị phân ổn định 64

Hình 5 Cấu trúc không gian của enterocin AS-48

1.3.3 Cơ chế hoạt động

Đích tấn công của AS-48 là màng tế bào chất vi khuẩn bằng cách dung hợp giữa phân tử với màng tế bào để hình thành các lỗ hay kênh có đường kính khoảng 7Ao, phá vỡ điện thế màng và tiêu hao lực proton PMF (do sự ngừng vận chuyển tích cực và điện thế dương cao của AS-48 gắn với màng mang điện âm) 63, 46 Điều này dẫn đến một sự thẩm thấu không phụ thuộc điện thế màng, làm tăng tính thấm màng cho các ion và các phân tử nhỏ, dẫn đến giải phóng các bào quan trong

tế bào chất, phân giải tế bào đích 4, 6

Hình 6 Hai dạng tương tác nhị phân

Những nghiên cứu tinh thể học đã lý giải cho cơ chế tác động của AS-48 lên màng tế bào vi khuẩn: Đã là sự tồn tại hai dạng cấu trúc liên kết DF-I và DF-II (Dimeric Form) - dạng tương tác hai phân tử của AS-48 Dạng này tích điện cao hơn so với dạng đơn phân (monomer), do đó khả năng hòa tan trong dung dịch lớn hơn Quá trình tác động gồm sự chuyển dịch từ dạng DF-I hòa tan trong nước thành dạng gắn màng DF-II 63 Dạng DF-I trong dung dịch có 85% vùng bị che lấp tương tác với các gốc kỵ nước Dạng gắn màng DF-II cô lập phần kỵ nước của AS-

48 - chôn vùi vào trong màng, phần ưa nước tiếp xúc với dung môi (H4, H5 ưa nước tương tác với nhau còn H1, H2 và H3 kỵ nước) Sự sắp xếp lại trong cấu trúc không gian giữa các chuỗi xoắn kép chuyển AS-48 từ dạng hòa tan trong nước DF-I sang dạng gắn màng DF-II Sự chuyển dịch này dẫn đến sự quay 90o của mỗi đơn phân protomer trong DF-I, làm các chuỗi xoắn kép kỵ nước bị che khuất một phần H1, H2(thời điểm lưỡng cực mạnh mẽ của DF-I giúp AS-48 tiếp cận với màng) để dung môi có thể tới được Trạng thái này cho phép AS-48 cài vào trong màng Sự cài xen của AS-48 vào màng vi khuẩn sẽ tạo sự tích lũy điện tích dương trên bề mặt màng, làm mất ổn định điện thế màng dẫn đến sự phá vỡ màng, cuối cùng làm tiêu bào

64

Hình 7 Cơ chế xuyên màng

a) DF-II và phân tử photpho lipit

b) DF-I, DF-II và xuyên màng

(a)

(b) (a)

Hiện nay, nhiều nghiên cứu đang được tiến hành để tìm hiểu cơ chế hoạt động của AS-48 lên vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm cũng như ảnh hưởng của các yếu tố môi trường diễn ra trong thực phẩm Ví dô: Enterocin AS-48 có tiềm

năng ứng dụng như là yếu tố bảo vệ chống lại S aureus trong thực phẩm do tạo

enterotoxin A (SEA) TÝnh nhạy cảm của chủng này với AS-48 kết hợp các xử lý

sử dụng trong chế biến thực phẩm như pH, nhiệt độ và NaCl đã được nghiên cứu kỹ

6

1.3.4 Sinh tổng hợp AS-48 trong tự nhiên

Enterocin AS-48 được tổng hợp nhờ gen cấu tróc as-48A dưới dạng tiền thân

pre-propeptit 105 axit amin gồm một peptit tín hiệu 35 axit amin và pre-peptit 70 axit amin Peptit tín hiệu chứa một đầu N mang điện dương đặc trưng (4 gốc) với một chuỗi kỵ nước và một vùng phân cực bên cạnh vị trí cắt Sự tạo phân tử trưởng thành cần một loạt biến đổi trong quá trình tiết thông qua các sự kiện nối tiếp nhau: Sản phẩm tiền thân AS-48 được phân cắt giữa His-1 và Met+1 bằng một peptidase đặc hiệu để tạo một pre-peptit Pre-peptit này phải thực hiện sự thay đổi sau phiên

mã bằng liên kết giữa đầu N của Met+1

với đầu C của Trp+70, loại một phân tử nước

để tạo phân tử trưởng thành, có hoạt tính 46, 63

Quá trình tổng hợp bacteriocin thường diễn ra trong pha sinh trưởng và dừng đến giữa hay sau pha sinh trưởng hoặc pha cân bằng 12 Khi sù sinh trưởng dừng, nồng độ bacteriocin thường giảm Nguyên nhân có thể do sù thủy phân của protease, kết hợp và hấp thụ qua màng Các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, nguồn C, N, P, các cation hoạt động bề mặt và các chất ức chế (nồng độ NaCl cao thường giảm mức sản xuất) ảnh hưởng đến sự tổng hợp bacteriocin 12 Bacteriocin có thể được tạo ra từ nhiều nguồn C khác nhau như glucose, saccarose, xylose, galactose Chủng sản xuất, dạng nuôi cấy cũng là những yếu tố quan trọng trong tối ưu hóa quá trình lên men thu bacteriocin Error! Reference source not found.

Hình 8 Trình tù gen as-48A

Hình 9 Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp enterocin AS-48

1.4 BIỂU HIỆN ENTEROCIN AS-48

1.4.1 Hệ vector biểu hiện pTWIN

1.4.1.1 Hệ IMPACT-TWIN

IMPACT-TWIN là một hệ thống tinh sạch protein mới, sử dụng hoạt tính tự cắt của các yếu tè nối ghép protein - gọi là các intein (một đoạn bên trong của protein) để phân tách protein từ đầu ái lực IMPACT-TWIN là kết quả nghiên cứu

và Trp+70

của New England Biolabs (hãng BioLabs) Sù nối ghép protein được nghiên cứu rộng rãi và khai thác trong tinh sạch các protein tái tổ hợp Đây là một quá trình cải biến sau dịch mã tương tự với sù nối ghép ARN Trong quá trình này, các intein xúc tác cho sự tù nối ghép từ một protein tiền thân với sự gắn đồng thời của trình tự polypeptit bên cạnh, gọi là các extein, qua một liên kết peptit tự nhiên 53, 66

Hơn 100 intein được xác định trong protein tế bào từ nhiều sinh vật Hầu hết các intein chứa một axit amin Cys hay Ser ở đầu N và một Asn (asparagin) ở đầu C

Cách nối ghép protein của intein Sce VMA (từ gen Saccharomyces cerevisiae

VMA1) được nghiên nhiều nhất và là đại diện cho hầu hết các intein Các gốc bảo tồn ở những phần nối ghép intein tham gia trực tiếp trong phản ứng nối ghép protein Sù thay thế một hay nhiều hơn axit amin trong intein có thể phá hủy phản

ứng nối ghép Ví dụ, sự thay thế Asn đầu C bằng Ala ngăn cản sù nối ghép in vivo

nhưng lại cho phép phân cắt protein dung hợp không bị ảnh hưởng của yếu tố thiol nh- DTT (1,4-Dithiothreitol) ở đầu N intein Những thay thế khác có thể ngăn cản

sự phân cắt in vitro của DTT hay thậm chí là sự thay đổi pH và nhiệt độ 66

Các đầu ái lực thường được sử dụng để thuận tiện trong tinh sạch protein tái

tổ hợp Ví dụ, đầu protein gắn maltose E coli (maltose-binding protein tag-MBP), đầu transferase S glutathion Schistosoma (GST) và đuôi polyhistidin Các đầu ái

lực này có thể can thiệp đến cấu trúc hay hoạt tính protein đích và thường phải sử dụng một protease để phân cắt chóng Do đó, quá trình thu protein tái tổ hợp cần phải thêm các bước tinh sạch để tách biệt protease và đầu dung hợp Hơn nữa, protease thường không đặc hiệu và dẫn đến các sản phẩm protein bị phân cắt một phần Trong khi đó, hệ thống IMPACT-TWIN có nhiều ưu điểm: 1) Phân tách dễ dàng các protein tự nhiên không cần một đầu ái lực (đầu ái lực này có thể thay đổi các đặc tính của protein) 2) Loại bỏ xử lý protease ngoại sinh - tốn kém, không đặc hiệu, thay vào đó là sử dụng hoạt tính tự cắt của intein phân cắt các vị trí mong muốn 3) Cho phép sử dụng một chất giá sắc ký không đắt đỏ - chitin - thực hiện bước bắt giữ chọn lọc cao 4) Được sử dụng trong sù nối ghép protein thông qua

intein (Intein-mediated protein ligation - IPL) để gắn các protein, peptit mét cách đặc trưng hay đánh dấu đặc hiệu đầu N hay C của protein đích bằng cách sử dụng hoá chất (fluorescein hay biotin), tạo các loại protein vòng (qua phản ứng nội phân tử) 53, 75 Nh- vậy, đây là một hệ thống tinh sạch đơn giản và Ýt tốn kém Một vài hệ thống dung hợp intein đã được phát triển cho tinh sạch protein ái lực sử dụng

các intein khác nhau, như intein Sce VMA, intein Mycobacterium xenopi gyrase A, các intein Synechocystis sp dnaB và dnaE và intein Mycobacterium tuberculosis

RecA 66

Hệ thống IMPACT-TWIN được phát triển để tạo các protein hay peptit vòng

và các protein đa phân tử 75, cho phép protein đích được cài giữa hai intein tự cắt

Các vùng nối với chitin (Chitin binding doimans - CBD từ Bacillus circulans) có

mặt trong cả hai intein cho phép tinh sạch ái lực của protein tiền thân qua cột chitin Do đó, các intein không chỉ là công cụ hữu Ých trong biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp mà còn có vai trò quan trọng trong nhiều nghiên cứu với các protein cải biến 53, 66, 75

Hình 10 Quá trình tạo protein vòng nhờ hai đầu intein

1.4.1.2 Hệ vertor pTWIN

Hệ vector pTWIN được sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp

trong E coli Việc sử dụng vector cụ thể và quá trình tạo dòng phụ thuộc vào mục

đích và đặc tính của protein đích Cả pTWIN1 (7375 bp) và pTWIN2 (7192 bp) đều

chứa các vị trí cắt của enzyme giới hạn Sap I cho phép gen mong muốn được tạo

dòng giữa hai đầu intein để có thể tinh sạch sản phẩm protein độc lập, không phụ thuộc sự dung hợp với bất kỳ axit amin nào Vector pTWIN1 và pTWIN2 đều sử

dụng intein1 là Ssp DnaB và chỉ khác nhau ở intein2 Intein2 trên pTWIN1 sử dụng intein cải biến Mxe GyrA trong khi pTWIN2 sử dụng intein cải biến Mth RIR1

Mặc dù vậy, cả hai vector đều chứa cùng trình tự MCS giúp đơn giản hóa sự cài xen gen đích vào cả hai vector nhằm xác định plasmid biểu hiện tối ưu 53

Intein1 Ssp DnaB có cơ sở là yếu tè nối ghép protein từ gen dnaB của Synechocystis sp PCC6803 Đây là intein nhá (154 axit amin), được biến đổi từ đoạn có chiều dài đủ 429 axit amin (Ssp DnaB mini-intein) Phần quan trọng được hình thành bởi sự thay thế axit amin Cys đầu N của Ssp DnaB mini-intein với một

Ala để ngăn chặn sù nối ghép protein của nó và hoạt động phân cắt đầu N Điều này biến đổi intein phân cắt liên kết peptit giữa intein và protein đích đầu C trong điều

kiện phụ thuộc pH Phản ứng phân cắt đầu C ở Ssp DnaB mini-intein cho pH thích

hợp nhất là 6,0-7,5, nhưng bị ngăn cản ở pH dưới 5,5 và trên 8,0

Intein2 trên pTWIN1 có 198 axit amin từ gen Mycobacterium xenopi gyr A (Mxe Gyr A intein), được tạo ra bằng cách thay thế axit amin cuối cùng Asn 198 bởi

Ala, để phân cắt hiệu quả với axit 2-mercaptoethanesulfonic (MESNA), DTT Hơn

nữa, Mxe GyrA intein đột biến (Asn 198 Ala) phân cắt hiệu quả hơn với MESNA so với Sce VMA intein đột biến (Asn 454 Ala) và do đó phù hợp với quá trình nối ghép protein intein Intein Mxe GyrA trên các vector nh- pTXB1, pTXB3 hay

pTWIN1 được sử dụng trong quá trình tổng hợp protein gây độc tế bào vi khuẩn

Trong khi đó, intein2 trên pTWIN2 là intein Mth RIR1 (từ gen Methanobacterium thermoautotrophicum rir1) có 134 axit amin mang đột biến thay thế Cys bởi Ala

phân cắt đầu N ở điều kiện phụ thuộc pH và nhiệt độ 53

pTWIN có những thành phần nh- điểm khởi đầu sao chép, các gen quy định dấu chuẩn chọn lọc, vùng khởi đầu phiên mã, các vùng đa điểm cắt đơn Đặc biệt,

hệ này có những ưu điểm vượt trội so với các hệ vector biểu hiện khác nh-:

- Gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter của bacteriophage T7 - promoter

mạnh và có tính đặc hiệu cao Quá trình phiên mã được điều hòa bởi lacI

- Vùng đa điểm cắt đơn có nhiều điểm nhận biết của enzyme hạn chế thích hợp

- Tâm tái bản ADN từ thực khuẩn thể M13 cho phép sự tạo thành ADN sợi đơn

sử dụng thực khuẩn thể hỗ trợ (M13K07 Helper Phage)

- Năm đầu phiên mã nối tiếp (rrnB T1) ngược dòng trình tự promoter T7 giảm

tối thiểu sự phiên mã nền

- Các vector pTWIN mang gen chọn lọc AmpR (gen bla) truyền tính kháng

ampicillin sang tế bào chủ Tất cả các vector mang tâm tái bản từ pBR322

- Protein đích tạo ra tinh sạch dễ dàng nhờ hai đầu intein gắn với CBD 53, 66 Như vậy, hệ vector pTWIN không những thuận lợi cho việc biểu hiện mà còn cho quá trình tinh sạch protein ngoại lai

Nhân dòng và biểu hiện

Phân cắt cảm ứng pH intein1

Phân cắt cảm ứng thiol

Tách rửa

Protein đích

Hình 11 Mô hình biểu hiện và tinh sạch thu protein vòng; CBD: Vùng protein gắn

với hạt chitin; Target protein: Protein đÝch; MCS: Vùng đa điểm cắt

1.4.2 Chủng vi khuẩn biểu hiện E coli ER2566

Trong quá trình biểu hiện gen ngoại lai, một số protein tạo ra rất độc đối với

tế bào E coli Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp sẽ bị hạn chế Chủng biểu hiện E coli ER2566 được sử dụng có các ưu điểm nổi bật: Mang một bản sao ADN

hệ gen của gen T7 ARN polymerase dưới sự điều khiển của promoter lac cảm ứng

IPTG T7 ARN polymerase là mét enzyme hoạt động rất mạnh, có tốc độ kéo dài

chuỗi nhanh gấp 5 lần so với các ARN polymerase khác có nguồn gốc từ E coli Sù

có mặt của T7 ARN polymerase giúp tổng hợp số lượng lớn protein ngoại lai dưới

sự điều khiển của promoter T7 E coli ER2566 thiếu cả lon và ompT protease Kiểu gen của E coli ER2566: F--

fhuA2 lon ompT lacZ::T7 gene1 gal sulA11  mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-Tet S )2 R(zgb-210::Tn10)(Tet S ) endA1 dcm

(mcrC-53, 66

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Plasmid pJET1 do hãng Fermentas cung cấp được sử dụng làm vector tách dòng

- Hệ vector pTWIN1, pTWIN2 (hãng BioLabs) được sử dụng làm vector biểu hiện

- Trình tự gen mã hóa cho enterocin AS-48 được lấy trên ngân hàng Gen quốc tế (GENBANK) với mã ký hiệu DQ1988088

 Kháng thể

- Kháng thể kháng CBD từ huyết thanh thá (BioLabs)

- Kháng thể cộng hợp HRPO (Horse radish perosidase)

2.1.2 Hoá chất và enzyme

 Hoá chất

SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức), isoamylalcohol, chloroform (Roth, Đức), phenol, EtBr (Ethidium bromide), glycerol, agarose (Gribco, Mỹ), ethanol,

agar (Fluka, Đức), ampicillin (Merk, Đức), cao nấm men, bacto pepton, d-NTPs (Promega, Mỹ), MgSO4 (Biolabs, Anh), MgCl2, CaCl2, NaOH, NaCl, kali axetat, axit axetic, glucose, hóa chất trong bé kit tinh sạch ADN (Qiagen, Đức), IPTG, polyacrylamid, lysozym

2.1.4 Các môi trường và dung dịch sử dụng

2.1.4.1 Môi trường và dung dịch sử dụng trong biến nạp plasmid vào tế bào E coli

 Môi trường:

- Môi trường LB láng: Cao nấm men (0,5%), bactor pepton (1%), NaCl (1%)

- Môi trường chọn lọc LBA láng: Thành phần gồm môi trường LB lỏng, bổ

sung Amp để đạt nồng độ cuối cùng là 100 g/ml

- Môi trường LB đặc: LB lỏng, bổ sung 1,6% agar

- Môi trường LBA đặc: LBA lỏng, bổ sung 1,6% agar

- Môi trường SOC: Cao nấm men (0,5%), bactor pepton (2%), NaCl (10 mM),

KCl (2,5 mM), MgCl2 (10 mM), glucose (20 mM)

 Dung dịch : Dung dịch CaCl2 0,1 M vô trùng, giữ ở 4oC

2.1.4.2 Môi trường và dung dịch dùng trong tách ADN plasmid từ E coli

 Môi trường: Môi trường chọn lọc LBA láng

2.1.4.3 Các dung dịch dùng để chạy điện di ADN trên gel agarose

Bromophenol blue0,25 % 0,25 %

Xylen cyanol FF0,25 % 0,25 %

- Dung dịch nhuộm gel: EtBr 0,5 g/ml

2.1.4.4 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide -SDS

- Bis-acrylamide 30%:

Dung dịch gồm 30 gam acrylamide và 0,8 gam bis-acrylamide hoà tan trong

100 ml nước cất vô trùng, bảo quản ở 4o

Cân 10 mg amonium persulfat hoà vào 900 mg H2O

- TEMED: sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ các công ty

- Gel polyacrylamide cho một bản gel:

STT Hoá chất Gel tách 12,6% (4,5 ml) Gel cô 0,5% (0,8 ml)

2 Tris- HCl 1,125 ml (1,5 M; pH 8,8) 0,2 ml (0,5 M; pH 6,8)

3 Glycerol 50% 0,9 ml