- Chương trình chạy:
d) Quan sát và chụp ảnh
2.2.9. Biểu hiện protein tái tổ hợp
Cơ sở lý thuyết:
Chủng E. coli ER2566 mang gen tái tổ hợp được nhân lên trong môi trường LBA láng. Khi tế bào chuyển sang pha sinh trưởng, sự có mặt của chất cảm ứng IPTG sẽ kích thích promoter T7 hoạt động mạnh. Kết quả tạo ra sản phẩm protein ngoại lai.
Quy trình:
- Cấy lắc qua đêm một khuẩn lạc trong 2 ml LBA láng.
- Chuyển dịch nuôi cấy sang môi trường LBA lỏng mới (pha loãng 100 lần), lắc tiếp khoảng 2 giê ở 37oC đến khi đạt được OD600 ~ 0,7 thì lấy ra và tiến hành cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng ở các mức khác nhau.
- Tiếp tục cấy lắc các mẫu cảm ứng ở nhiệt độ tùy chọn.
- Thu mẫu vào các eppendorf và ly tâm 6000 vịng/phút trong 5 phót để thu tủa tế bào.
chất ức chế protease) đến nồng độ cuối là 0,05 M và làm tan tế bào bằng máy
vortex. Sau đó, để mẫu ở -80oC qua đêm. - Sốc nhiệt mẫu ở 42oC trong 10 phót. - Bổ sung lysozym (20 g/ml), ủ ở 4o
C trong 1 giê.
- Ly tâm ở 13000 vịng/phút trong 5 phót, thu dịch nổi là phần protein nằm trong khoang chu chất được giải phóng ra khi phá vỡ tế bào bằng lysozym.
- Tiếp theo phá vỡ tế bào bằng đệm xử lý và biến tính protein ở 100oC trong 10 phót.
- Điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide, nhuộm bản gel bằng coomassie briliant blue trong 1 giê và rửa lại bằng dung dịch tẩy rửa cho đến khi quan sát được các băng protein.