- Chương trình chạy:
d) Quan sát và chụp ảnh
3.3.2.1. Nhiệt độ cảm ứng
E. coli sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ ở 37oC. Nhưng trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp, nhiệt độ này thường không được lùa chọn. Nguyên nhân chính là tại nhiệt độ này, protease được sinh ra nhiều và có hoạt tính mạnh (do địi hỏi cao về nguồn dinh dưỡng cho sù sinh trưởng). Để tránh tác dụng của protease, có thể tiến hành biểu hiện ở nhiệt độ thấp, đồng thời bổ sung các chất ức chế protease trong quá trình ni cấy. Mặt khác, khi sinh trưởng với tốc độ cao, các bản sao plasmid trong tế bào thường giảm. Đồng thời, protein ngoại lai được tổng hợp quá mạnh sẽ không đảm bảo về chất lượng (do các protein bảo mẫu giúp hình thành đúng cấu trúc phân tử không đáp ứng đủ) dẫn đến sản phẩm protein chủ yếu ở dạng không tan. Đây là dạng protein khơng có hoạt tính sinh học do sai lệch trong quá trình hình thành cấu trúc khơng gian. Do đó, trong quá trình tối ưu sự biểu hiện protein tái tổ hợp AS-48 này, việc khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ là rất quan trọng. Các chủng tế bào mang vector pTWIN-as48 được tiến hành lên men ở các nhiệt độ khác nhau (37o
C, 30oC, 22oC), có cảm ứng bằng IPTG 0,5 mM. Kết quả được trình bày ở hình 19.
Hình 19. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng đến khả năng biểu hiện của gen as-48
trong tế bào E. coli ER2566
Đường chạy 1, 6: Protein tổng số của dòng tế bào đối chứng mang vector pTWIN1, pTWIN2
Đường chạy 2-4; 7-9: Protein tổng số của dòng tế bào mang vector pTWIN1- as48, pTWIN2-as48 biểu hiện ở nhiệt độ cảm ứng lần lượt là 37, 30, 22oC
Đường chạy 5: Maker protein (Fermentas)
Phân tích kết quả hình 19 cho thấy: Trong các nhiệt độ khảo sát, protein tái tổ hợp ở hai hệ vector pTWIN1 và pTWIN2 đều được tổng hợp. Ở nhiệt độ 37, 30oC thể hiện trên các đường chạy sè 2, 3, 7, 8 đã cho phép tổng hợp protein tái tổ hợp với một lượng đáng kể. Còn ở 22oC trên đường chạy 4 và 9, protein tái tổ hợp biểu hiện kém hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ nuôi cấy 30oC được lùa chọn để biểu hiện protein tái tổ hợp trong các thí nghiệm tiếp theo, bởi ở nhiệt độ thấp hơn này, các protease sẽ hoạt động kém hơn (so với 37oC). Điều này sẽ giúp hạn chế ảnh hưởng phần nào của protease đến hiệu suất protein tái tổ hợp trong quá trình lên men. Kết quả biểu hiện còn cho thấy, hệ vector pTWIN1 cho khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp cao hơn so với hệ pTWIN2.