- Chương trình chạy:
3.2.3.Kiểm tra sự có mặt của gen as-48 trong vector pTWIN
d) Quan sát và chụp ảnh
3.2.3.Kiểm tra sự có mặt của gen as-48 trong vector pTWIN
Các sản phẩm biến nạp được chọn lọc dùa trên cơ chế kháng sinh. Chỉ những khuẩn lạc nào mà tế bào chứa vector pTWIN-as48 tái tổ hợp hoặc vector pTWIN (đối chứng) mới có thể sinh trưởng được trên môi trường chứa kháng sinh Amp nhờ hoạt động của gen kháng kháng sinh bla (AmpR) có sẵn trên vector.
Trong q trình nối ghép, vẫn có những trường hợp vector pTWIN tự đóng vịng (khơng chứa gen as-48). Để xác định các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, cần kiểm tra các dòng tế bào biến nạp. Chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trên đĩa thạch, nuôi lắc qua đêm trong LBA, tách ADN plasmid và tiến hành cắt kiểm tra.
Chúng tôi lùa chọn enzyme hạn chế Pst I để cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pTWIN-as48. Ưu điểm của lùa chọn này là: Trên vector pTWIN1 và pTWIN2 chỉ có một trình tự cắt của Pst I lần lượt ở vị trí 7228 và 7045. Đồng thời, trên gen as- 48 cịng chỉ có một trình tự cắt của Pst I ở vị trí 155 của gen. Hai vector pTWIN1
và pTWIN2 có kích thước tương ứng là 7375, 7192 bp; gen ngoại lai as-48 có kích thước 234 bp. Vì vậy, vector tái tổ hợp có kích thước tương ứng là 7609 bp và 7426 bp. Theo tính tốn lý thuyết, khi cắt bằng enzyme hạn chế Pst I, pTWIN1-as48 sẽ
6,72 kb. Sơ đồ cắt vector pTWIN-as48 bằng enzyme hạn chế Pst I và kết quả điện
di kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 1,7% được biểu thị ở hình 18.
A)B) B)
Hình 18. A) Sơ đồ cắt pTWIN-as48 bằng enzyme hạn chế Pst I.
B) Kiểm tra sản phẩm cắt pTWIN-as48 bằng Pst I trên gen agarose 1,7% Đường chạy số 1-3, 7-10: Sản phẩm cắt pTWIN1-as48, pTWIN2-as48 Đường chạy số 4, 6: pTWIN1, pTWIN2 đối chứng
Đường chạy số 5: Maker 1 kb (Fermentas)
Kết quả trên điện di đồ cho they: Đối với pTWIN1-as48, ở đường chạy số 1- 3 xuất hiện hai băng ADN có kích thước khoảng 0,9 và 6,7 kb; pTWIN2-as48, ở đường chạy số 7-10 xuất hiện hai băng ADN có kích thước khoảng 0,7 và 6,7 kb. Hai kết quả đều trùng khớp với tính tốn lý thuyết. Trong khi đó, hai vector đối chứng pTWIN1 và pTWIN2 ở đường chạy số 4 và 6 do không được cài gen as-48
nên không bị cắt bởi enzyme hạn chế Pst I. Kết quả điện di cho băng phản ánh đúng kích thước của hai vector (ở vị trí cao hơn so với vector tái tổ hợp tương ứng là pTWIN1-as48 và pTWIN2-as48). Căn cứ vào kết quả này, các dòng plasmid tái tổ hợp đã kiểm tra được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ~0,7 kb ~0,7 kb ~0,9 kb Một phần gen as-48 +Intein2-CBD (~ 0,9 kb) Pst I(155-as48) Pst I(7228) as-48 7,6 kb Sap I(6437) Sap I(6404)
Phần còn lại của vector (~ 6,7 kb)
3.3. BIỂU HIỆN GEN as-48 TRONG TẾ BÀO E. coli ER2566