- Chương trình chạy:
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
d) Quan sát và chụp ảnh
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Enterocin AS-48 là bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, tác động lên nhiều loại vi khuẩn gây háng thực phẩm và khá bền trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Đặc biệt, enterocin AS-48 cịn có khả năng ức chế bào tử (nh- bào tử của vi khẩn gây rối loạn tiêu hóa B. cereus). Vì vậy, AS-48 đã và đang được nghiên cứu
nhằm ứng dụng để bảo quản nhiều loại thực phẩm khác nhau như: Thịt, sữa, các sản phẩm dinh dưỡng cho trẻ em, các sản phẩm chế biến từ gạo, nước Ðp hoa quả.
Theo phương pháp lên men truyền thống từ các chủng tổng hợp của chi
Enterococcus, sản phẩm thu được thường lẫn độc tố (do chính vi khuẩn tiết ra), gây
có thể chủ động điều khiển q trình sinh tổng hợp, tạo các chủng có năng suất cao cũng như việc tinh chế, thu hồi enterocin. Từ năm 2005, hàng loạt cơng trình nghiên cứu biểu hiện enterocin trong nhiều hệ biểu hiện khác nhau như E. coli, B. subtilis, L. lactis, nấm men… đã được công bố. Tuy nhiên, đến nay chưa có thêm một
bacteriocin nào được sử dụng thương mại trong bảo quản sinh học thực phẩm. Trong những năm qua, một số cơ quan khoa học ở Việt Nam nh- viện Cơ
điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, khoa Công nghệ Sinh học - Đại học Bách Khoa Hà Nội… cũng đã bắt đầu nghiên cứu các bacteriocin. Cơng trình mới dừng lại ở việc phân lập các chủng sinh bacteriocin tự nhiên, tiến hành tối ưu lên men. Tuy nhiên, sản lượng còng nh- hoạt lực bacteriocin từ các chủng phân lập còn rất thấp. Kết quả là chế phẩm bacteriocin của đề tài sản xuất thử có giá thành rất cao, chưa thể ứng dụng vào thực tiễn. Trong khi đó, ở nước ta hiện nay, vẫn chưa có đơn vị nghiên cứu nào nghiên cứu tạo enterocin tái tổ hợp dùng trong bảo quản sinh học thực phẩm. Việc tạo ra các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enterocin AS- 48 bằng con đường tái tổ hợp là hoàn toàn khả thi. Định hướng này đã được cụ thể hóa bằng việc tiến hành tổng hợp và biểu hiện gen as-48 trong tế bào E. coli. Quy trình tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin AS-48 trong tế bào E. coli
Hình 12. Sơ đồ quá trình biểu hiện gen as-48 trong tế bào E. coli ER2566
Cặp mồi dài
Kpn 2I… Psp XI… Xho I… Blunt-ent PCR product… Xba I… Bsu15I
Sap I(6404)… Nco I… Not I… Eco RI… Pae R7-TII I-Xho I… Sap I(6437)
bla (AmpR) rep (pMB1) PlacUV5 eco47IR 3,4 kb rep (pMB1) AmpR PlacUV 5 eco47IR Sap I Sap I as-48 AmpR CBD CBD lac I rop ori -M13 ori+
Ssp Intein Mxe Intein
Pst I(7228) AmpR -M13 ori+ rop ori lac I CBD CBD Ssp Intein Mxe Intein Pst I(7228) as-48 Pst I(155-as48) 7,6 kb PCR tự mồi Taq polymerase Sap I Sap I Sap I Sap I T4-ADN ligase T4-ADN ligase
Biểu hiện gen as-48 trong E. coli ER2566
Western blot Pst I(1306) Pst I(1306) Pst I(155-as48) 7,4 kb pJET1 3,1 kb
Sau khi xác định trình tự gen mã hóa cho enterocin AS-48, chúng tôi tiến hành tổng hợp gen as-48 bằng kỹ thuật PCR tự mồi sử dụng hai cặp mồi được thiết kế đặc biệt. Sau khi được tổng hợp, gen as-48 được nối ghép vào vector tách dòng pJET1. Biến nạp sản phẩm nối ghép vào tế bào E. coli DH5 để chọn lọc các dòng tế bào mang gen tái tổ hợp. Sau khi nhân dịng thành cơng, as-48 được chuyển sang vector pTWIN và biểu hiện nhờ chủng vi khuẩn E. coli ER2566. Sự biểu hiện của gen as-48 tái tổ hợp dung hợp với hai đầu intein được kiểm tra qua kỹ thuật điện di protein tổng số trên gel polyacrylamid 12,6% và Western blot.
3.1. PHÂN LẬP VÀ TÁCH DÒNG GEN as-48