- Chương trình chạy:
d) Quan sát và chụp ảnh
2.2.11. Phương pháp Western blot
Cơ sở lý thuyết:
Protein sau khi được điện di trên gel polyacrylamid được chuyển sang một màng lai. Sử dụng kháng thể đặc hiệu để nhận biết khả năng liên kết miễn dịch của protein đó. Phương pháp có thể biến đổi tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu và loại protein. Phổ biến nhất là dùng phương pháp kháng thể cộng hợp peroxidase.
Quy trình:
- Chuẩn bị màng: Màng PVDF được xử lý bằng methanol trong 5 phót, sau đó ngâm trong dung dịch blotting 1X để lạnh.
- Protein tổng số sau khi điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid 12,6% được chuyển sang màng lai PVDF nhờ hệ thống chuyển màng Bio-Rad. Chuyển màng trong 2 giê với hiệu điện thế U=100 V.
- Màng chứa kháng nguyên được phủ bằng casein của sữa (5% sữa tách bơ pha trong dung dịch TBS 1X) qua đêm. Rửa màng 3 lần bằng TTBS 1X, mỗi lần 10 phót. Rửa tiếp 3 lần bằng TBS 1X, mỗi lần 5 phót.
- Nhuộm màng bằng kháng thể 1 với độ pha lỗng 1/5000 (hịa trong dung dịch sữa 5%), lắc trong 3 giê ở nhiệt độ phòng. Đây là kháng thể kháng CBD (anti- chitin-binding domain trong huyết thanh thá do hãng BioLabs cung cấp). Rửa màng tương tù nh- các bước trên để loại bỏ hồn tồn các liên kết khơng đặc hiệu.
- Nhuộm màng bằng kháng thể 2 (kháng thể cộng hợp HRPO kháng thá) với độ pha loãng 1/10000 trong 3 giê.
- Màng sau khi rửa bằng TTBS 1X, TBS 1X, được nhuộm trong dung dịch cơ chất cho perosidase 10 phót ở nhiệt độ phòng. Xem kết quả trong ánh sáng thường và dừng phản ứng bằng nước cất. Màng được bảo quản lạnh trong giấy nilon và tránh ánh sáng.