- Chương trình chạy:
3.1.2.Thiết lập hệ vector tách dòng pJET1 mang gen as-
d) Quan sát và chụp ảnh
3.1.2.Thiết lập hệ vector tách dòng pJET1 mang gen as-
Mục đích của việc tách dịng nhằm thu lượng lớn bản sao chứa trình tự ADN xác định. Do vậy, điều quan trọng của vectơ tách dòng là phải biến nạp thuận tiện
1 2 3 4 bp bp 500 400 300 200 100 0,23 kb
vào tế bào chủ và dễ dàng nhận biết sự tồn tại. Phụ thuộc vào kích thước đoạn ADN đích và mục đích tách dịng mà lùa chọn vectơ thích hợp.
Vector pJET1 được lùa chọn để tách dòng gen as-48 với những đặc điểm ưu việt: Kích thước nhỏ 3128 bp, có số lượng bản sao lớn trong tế bào E. coli. Bản đồ cắt của enzyme hạn chế đơn giản và dễ thao tác. pJET1 có khả năng tạo dòng gen từ sản phẩm PCR tối ưu, khả năng nối ghép với các đoạn ADN đầu bằng (hai đầu bằng ở vị trí nucleotit 497 và 498, nên khi nối ghép sản phẩm PCR với pJET1 không cần xử lý trước bằng enzyme hạn chế). Q trình chọn lọc những dịng tế bào mang gen tái tổ hợp thuận tiện nhờ khả năng sinh trưởng trên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh Amp. Đặc điểm này là do vùng đa điểm cắt nằm trên gen eco47IR, mã hóa cho mét endonuclease Eco47I gây chết tế bào chủ E. coli. Chỉ những dòng tế bào mang gen tái tổ hợp mới chứa gen eco47IR đột biến (khơng cịn khả năng gây độc do
ADN ngoại lai cài vào đã phá vỡ tính tồn vẹn của eco47IR). Theo nguyên tắc này, các dòng tế bào sinh trưởng trên môi trường chọn lọc đều chứa gen ngoại lai. Ngược lại, các dịng tế bào mang plasmid khơng được cài ADN ngoại lai sẽ không sinh trưởng được ngay từ những lần phân chia đầu tiên.
Để tiến hành tách dịng, sản phẩm PCR với kích thước mong muốn được nối ghép trực tiếp vào vector tách dòng pJET1 nhờ T4-ADN ligase. Enzyme này có nguồn gốc từ tế bào E. coli bị nhiễm thực khuẩn thể T4, được sử dụng phổ biến
trong phản ứng nối ghép gen bởi hoạt tính cao trong việc nối ghép cả các đoạn ADN đầu dính và đầu bằng.
Tỷ lệ phản ứng nối ghép là 3:1 giữa sản phẩm PCR và vector pJET1. Phản ứng được tiến hành theo quy trình đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Hỗn hợp sau phản ứng được biến nạp vào tế bào E. coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt. Để thuận tiện, chúng tôi đặt tên cho plasmid tái tổ hợp thu được là pJET1-as48.