- Chương trình chạy:
d) Quan sát và chụp ảnh
3.3.2.2. Nồng độ chất cảm ứng IPTG
Nồng độ chất cảm ứng cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. IPTG - chất cảm ứng được sử dụng phổ biến trong các thí nghiệm sinh học phân tử là một cơ chất khá đắt tiền. Sử dụng IPTG
1 2 3 4 5 6 7 8 9 kDa 116 116 66,2 45 35 25 56 62
với nồng độ cao sẽ gây tốn kém về mặt kinh tế, đó là chưa kể đến việc nó cũng có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến hiệu suất biểu hiện của protein ngoại lai (trong một số trường hợp). Chính vì vậy, việc xác định nồng độ IPTG thích hợp là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn (khi tiến hành lên men với quy mơ lớn). Trong thí nghiệm này, nồng độ chất cảm ứng IPTG theo năm mức đã được khảo sát là 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 và 1,5 mM khi tiến hành lên men các chủng mang protein tái tổ hợp ở 30oC, thời gian cảm ứng 4 giê. Kết quả được thể hiện trên hình 20.
Hình 20. Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến khả năng biểu hiện của
as-48 trong E. coli ER2566
A) pTWIN1-as48
Đường chạy 1: Chủng đối chứng mang vector pTWIN1, IPTG là 0,5 mM Đường chạy 2: Maker protein (Fermentas)
Đường chạy 3-7: Chủng mang vector pTWIN1-as48 biểu hiện ở IPTG lần lượt là 1,5; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 mM
B) pTWIN2-as48
Đường chạy 1: Chủng đối chứng mang vector pTWIN2, IPTG là 0,5 mM Đường chạy 2: Maker protein (Fermentas)
Đường chạy 3-7: Chủng mang vector pTWIN2-as48 biểu hiện ở IPTG lần lượt là 1,5; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 mM
Kết quả điện di đồ cho thấy: Có sự khác biệt đáng kể về mức độ biểu hiện enterocin AS-48 tái tổ hợp ở các nồng độ IPTG khác nhau. Ở mức nồng độ IPTG thấp nhất 0,1 mM cho kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp thấp nhất. Đáng chú ý là ở nồng độ IPTG cao gấp nhiều lần là 1,0 và 1,5 mM cho mức độ biểu hiện tuy lớn
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 62 kDa 62 kDa 56 kDa A) B) kDa 116 66,2 45
hơn (so với nồng độ cảm ứng 0,1 mM) nhưng không bằng ở mức nồng độ chất cảm ứng là 0,2 và 0,5 mM. Điều này có thể là do khi IPTG ở nồng độ cao đã gây ra hiện tượng ức chế ngược lên quá trình biểu hiện của gen as-48 (do kết quả biểu hiện
protein tái tổ hợp AS-48 - gây độc cho chính tế bào chủ mang gen as-48). Hiện
tượng này có thể liên hệ với những trường hợp biểu hiện protein mang tính độc cao trong tế bào E. coli, như các protein độc tố, các protein kháng nguyên virus... Phân
tích kết quả đã cho thấy, hàm lượng protein tái tổ hợp thu được cao nhất trong mơi trường có chứa 0,5 mM chất cảm ứng IPTG (đường chạy số 6 (A, B)).
Sau khi tối ưu được nhiệt độ (30oC) và nồng độ chất cảm ứng IPTG (0,5 mM) cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành lên men lượng lớn (dung tích 2 lít). Mục đích của việc lên men lượng lớn khơng chỉ là tối ưu hóa quá trình biểu hiện ở mức dung tích lớn mà cịn tạo lượng protein tái tổ hợp đủ cho quá trình cắt thu và tinh sạch về sau. Kết quả lên men lượng lớn được thể hiện ở hình 21.
Hình 21. Kiểm tra sản phẩm biểu hiện lượng lớn trên gel polyacrylamid 12,6%
Đường chạy số 1: Maker protein (Fermentas)
Đường chạy số 2, 4: Chủng đối chứng mang vector pTWIN2, pTWIN1 Đường chạy số 3, 5: Chủng mang vector pTWIN2-as48, pTWIN1-as48
1 2 3 4 5 kDa kDa 116 66,2 45 35 25 18 14,4
Kết quả biểu hiện lượng lớn cho thấy: Trên đường chạy số 3, 5 cho băng màu đậm nét tương ứng với kích thước của protein dung hợp. Điều này chứng tỏ protein tái tổ hợp biểu hiện rất mạnh. Đồng thời trên hai đường chạy đối chứng (số 2, 4), ngoài hai băng đối chứng có kích thước tương ứng là 49, 55 kDa (pTWIN2, pTWIN1), cịn có các băng biểu hiện với kích thước bé hơn (từ 24-35 kDa). Đặc biệt, trên đường chạy số 4, cho băng đậm nhất có kích thước hơn 30 kDa. Điều này có thể do trong q trình biểu hiện lượng lớn, pH mơi trường lên men giảm dẫn đến sự phân cắt các intein. Kết quả protein dung hợp bị phân cắt cho những phần có kích thước bé hơn. Yếu tố pH cần được kiểm soát chặt chẽ trong trường hợp này.
Như vậy, sau khi khảo sát các điều kiện ni cấy để tối ưu hóa sự biểu hiện gen as-48 tái tổ hợp dạng dung hợp trong tế bào E. coli ER2566, chúng tơi đã có kết luận: Điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 30oC sau khi cảm ứng và nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM là thích hợp, cho hiệu suất cao nhất trong việc biểu hiện và thu protein tái tổ hợp enterocin AS-48.