b) Hình thành liên kết peptit giữa Met+
1.4.1.2. Hệ vertor pTWIN
Hệ vector pTWIN được sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Việc sử dụng vector cụ thể và q trình tạo dịng phụ thuộc vào mục đích và đặc tính của protein đích. Cả pTWIN1 (7375 bp) và pTWIN2 (7192 bp) đều
chứa các vị trí cắt của enzyme giới hạn Sap I cho phép gen mong muốn được tạo dịng giữa hai đầu intein để có thể tinh sạch sản phẩm protein độc lập, khơng phụ thuộc sự dung hợp với bất kỳ axit amin nào. Vector pTWIN1 và pTWIN2 đều sử dụng intein1 là Ssp DnaB và chỉ khác nhau ở intein2. Intein2 trên pTWIN1 sử dụng intein cải biến Mxe GyrA trong khi pTWIN2 sử dụng intein cải biến Mth RIR1.
Mặc dù vậy, cả hai vector đều chứa cùng trình tự MCS giúp đơn giản hóa sự cài xen gen đích vào cả hai vector nhằm xác định plasmid biểu hiện tối ưu 53 .
Intein1 Ssp DnaB có cơ sở là yếu tè nối ghép protein từ gen dnaB của Synechocystis sp. PCC6803. Đây là intein nhá (154 axit amin), được biến đổi từ
đoạn có chiều dài đủ 429 axit amin (Ssp DnaB mini-intein). Phần quan trọng được hình thành bởi sự thay thế axit amin Cys đầu N của Ssp DnaB mini-intein với một
Ala để ngăn chặn sù nối ghép protein của nó và hoạt động phân cắt đầu N. Điều này biến đổi intein phân cắt liên kết peptit giữa intein và protein đích đầu C trong điều kiện phụ thuộc pH. Phản ứng phân cắt đầu C ở Ssp DnaB mini-intein cho pH thích hợp nhất là 6,0-7,5, nhưng bị ngăn cản ở pH dưới 5,5 và trên 8,0.
Intein2 trên pTWIN1 có 198 axit amin từ gen Mycobacterium xenopi gyr A
(Mxe Gyr A intein), được tạo ra bằng cách thay thế axit amin cuối cùng Asn 198 bởi Ala, để phân cắt hiệu quả với axit 2-mercaptoethanesulfonic (MESNA), DTT. Hơn nữa, Mxe GyrA intein đột biến (Asn 198 Ala) phân cắt hiệu quả hơn với MESNA so với Sce VMA intein đột biến (Asn 454 Ala) và do đó phù hợp với quá trình nối
ghép protein intein. Intein Mxe GyrA trên các vector nh- pTXB1, pTXB3 hay
pTWIN1 được sử dụng trong quá trình tổng hợp protein gây độc tế bào vi khuẩn. Trong khi đó, intein2 trên pTWIN2 là intein Mth RIR1 (từ gen Methanobacterium thermoautotrophicum rir1) có 134 axit amin mang đột biến thay thế Cys bởi Ala
phân cắt đầu N ở điều kiện phụ thuộc pH và nhiệt độ 53.
pTWIN có những thành phần nh- điểm khởi đầu sao chép, các gen quy định dấu chuẩn chọn lọc, vùng khởi đầu phiên mã, các vùng đa điểm cắt đơn. Đặc biệt, hệ này có những ưu điểm vượt trội so với các hệ vector biểu hiện khác nh-:
- Gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter của bacteriophage T7 - promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao. Q trình phiên mã được điều hịa bởi lacI.
- Vùng đa điểm cắt đơn có nhiều điểm nhận biết của enzyme hạn chế thích hợp.
- Tâm tái bản ADN từ thực khuẩn thể M13 cho phép sự tạo thành ADN sợi đơn sử dụng thực khuẩn thể hỗ trợ (M13K07 Helper Phage).
- Năm đầu phiên mã nối tiếp (rrnB T1) ngược dịng trình tự promoter T7 giảm tối thiểu sự phiên mã nền.
- Các vector pTWIN mang gen chọn lọc AmpR (gen bla) truyền tính kháng
ampicillin sang tế bào chủ. Tất cả các vector mang tâm tái bản từ pBR322.
- Protein đích tạo ra tinh sạch dễ dàng nhờ hai đầu intein gắn với CBD 53, 66. Như vậy, hệ vector pTWIN khơng những thuận lợi cho việc biểu hiện mà cịn cho quá trình tinh sạch protein ngoại lai.
Nhân dòng và biểu hiện Phân cắt cảm ứng pH intein1 Phân cắt cảm ứng thiol Tách rửa Protein đích
Hình 11. Mơ hình biểu hiện và tinh sạch thu protein vòng; CBD: Vùng protein gắn
với hạt chitin; Target protein: Protein đÝch; MCS: Vùng đa điểm cắt.