- Chương trình chạy:
d) Quan sát và chụp ảnh
3.4. KIỂM TRA ENTEROCIN AS-48 TÁI TỔ HỢP BẰNG KỸ THUẬT WESTERN BLOT
BLOT
Trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp này, mét điểm thiết yếu cần phải xác định: Protein biểu hiện phải chính xác là enterocin AS-48. Để khẳng định điều này, không đơn giản là việc xác định lượng protein biểu hiện qua băng bằng điện di protein tổng số trên gel polyacrylamid mà còn phải dùa trên các đặc điểm khác. Một trong những kỹ thuật để xác định chính xác protein tái tổ hợp đã được biểu hiện là lai miễn dịch Western blot.
Trong thí nghiệm này, dùa trên đặc tính của hệ biểu hiện pTWIN là sự dung hợp protein đích với hai protein intein gắn với CBD. Protein đích đã được biểu hiện trong vô số sản phẩm protein khác nhau được xác định gián tiếp qua protein CBD- có ái lực cao với chitin. Sử dụng kháng thể kháng protein gắn kết chitin (kháng thể 1 từ huyết thanh thá) đã được thương mại (BioLabs), protein dung hợp được nhận biết bằng lai miễn dịch Western blot.
Để thực hiện thí nghiệm, protein tái tổ hợp dạng dung hợp sau khi chạy kiểm tra trên gel polyacrylamid 12,6% được chuyển sang màng PVDF (theo nh- phần
phương pháp đã mô tả). Các khoảng trống trên bề mặt màng được phủ kín bằng casein sữa, nhằm tránh sự gắn trực tiếp lên màng các kháng thể sau này. Kháng thể đặc hiệu kháng CBD (kháng thể 1) chỉ gắn với kháng nguyên CBD nối đoạn dung hợp intein-AS48. Các liên kết không đặc hiệu khác bị loại bỏ hồn tồn trong q trình rửa. Tiếp đó, màng được nhuộm với kháng thể kháng thá cộng hợp HRPO (kháng thể 2). Kháng thể này chỉ liên kết đặc hiệu với kháng thể 1. Nh- vậy, sau khi nhuộm kháng thể, phức hệ kháng nguyên (kháng thể 1) - kháng thể 2 được hình thành. Phức hệ này được nhận biết bằng phản ứng màu xúc tác bởi peroxidase. Enzyme này liên kết trực tiếp với kháng thể 2, xúc tác phản ứng chuyển cơ chất là 4-chlorol-1-napthol thành sản phẩm không tan. Kết quả Western blot được thể hiện trên hình 22.
Hình 22. Kiểm tra sự biểu hiện protein tái tổ hợp bằng Western blot
Đường chạy 1, 4: Sản phẩm biểu hiện gen as-48 của chủng mang vector pTWIN1- as48, pTWIN2-as48
Đường chạy 2, 5: Protein đối chứng âm (pTWIN1, pTWIN2) Đường chạy 3: Thang protein chuẩn (Fermentas)
1 2 3 4 5 62 kDa 62 kDa kDa 160 110 90 70 55 45 35 25 15 10 56 kDa
Kết quả Western blot trên đường chạy số 1 và 4 đã cho một băng màu đậm nét tại vị trí tương ứng với băng của hệ protein dung hợp, kích thước đúng như tính tốn (62 kDa trong pTWIN1-as48 và 56 kDa trong pTWIN2-as48). Trong khi đó, đối chứng âm pTWIN1 và pTWIN2 cho các băng màu tại các vị trí tương ứng với kích thước bé hơn (đường chạy số 2 và 5). Băng cao nhất ứng với kích thước 55 kDa (pTWIN1) và 49 kDa (pTWIN2). Tuy nhiên, kết quả trên đường chạy số 1 và 4 ngoài băng màu đậm nét cịn có một số băng bé hơn có kích thước từ 25-55 kDa. Hiện tượng này được quan sát rõ hơn trên hai đường chạy đối chứng. Kết quả này có thể do hệ protein dung hợp bị phân cắt một phần intein-CBD do điều kiện môi trường. Kết quả Western blot còng cho thấy, protein tái tổ hợp trong hệ vector pTWIN1 cho khả năng biểu hiện tốt hơn so với hệ pTWIN2 (cho băng màu protein đặc hiệu đậm nét hơn, thể hiện trên đường chạy số 1).
Từ các kết quả thu được đã cho phép khẳng định: Protein AS-48 tái tổ hợp dạng dung hợp đã được tổng hợp và biểu hiện thành công trong hệ vector pTWIN.