- Chương trình chạy:
a)Tạo tế bào khả biến
- Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5 vào 5 ml mơi trường LB lỏng, lắc 200 vịng/ phót.
- Chuyển 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml mơi trường LB (pha lỗng 100 lần), tiếp tục cấy lắc 200 vòng/phút ở 37oC cho tới khi đạt OD600 0,4-0,6. Sau đó, lấy mẫu ra và đặt lên đá khoảng 1 giê. Từ bước này, tất cả các thao tác đều phải được tiến hành ở 4oC.
CaCl2 1 mM (vơ trùng). Ủ mẫu 15 phót và ly tâm thu tế bào ở 3500 vịng/phút trong 10 phót.
- Hoà tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu trong 60 phót trên đá. - Ly tâm 4000 vịng/phút trong 10 phót ở 4oC.
- Dịch hóa tế bào trong 0,5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glyxerol. - Hót 0,1 ml dịch tế bào trên vào mỗi ống eppendorf và bảo quản ở -80oC.
b) Biến nạp
- Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -80oC và được làm tan trên đá trong khoảng 30 phót (tránh bị sốc nhiệt).
- Lấy 4 l mẫu sản phẩm lai (ADN + T4-ADN ligase + vector), đảo nhẹ
nhàng để ADN phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó, để mẫu trên đá trong khoảng 15 phót.
- Sốc nhiệt 1 phót 30 giây bằng cách đưa mẫu chuyển sang bể ổn nhiệt 42oC. - Lấy mẫu ra, đặt trên đá trong 2 phót.
- Bổ sung khoảng 500 l LB lỏng, lắc ở 37o
C trong 45 phót.
- Hót 100 l dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LBA đặc, ủ đĩa ở
37oC qua đêm.
2.2.5. Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E. coli bằng xung điện
Cơ sở lý thuyết:
Các tế bào vi khuẩn đang phát triển ở giai đoạn giữa pha sinh trưởng được thu lại và rửa với nước khử ion để loại bỏ hết các ion còn tồn tại trong hỗn hợp tế bào. Khi tiến hành xung điện, dưới tác dụng của điện trường, các lỗ trên màng tế bào được mở ra tạo điều kiện cho các phân tử ADN plasmid di chuyển theo điện trường vào trong tế bào. Khi ngõng xung điện, cấu trúc màng tế bào được phục hồi trở lại, các phân tử ADN plasmid được giữ lại trong tế bào.
Quy trình:
a) Tạo tế bào khả biến
- Cấy chuyển một khuẩn lạc tế bào E. coli ER2566 vào 5 ml môi trường LB
lỏng, lắc ở 37oC, 200 vòng/phút qua đêm.
- Pha lỗng 100 lần, tiếp tục ni cấy cho đến khi đạt OD600 0,5-0,7 (tốt nhất là 0,6). Mẫu được lấy ra và để trong đá lạnh khoảng 15 phót.
- Ly tâm 5000 vịng/phút, 4oC trong 10 phót để thu tế bào. Tủa tế bào được hoà vào 100 ml nước khử ion lạnh, vô trùng.
- Ly tâm 5000 vịng/phút, 4oC trong 10 phót. Hồ lại tủa tế bào vào 100 ml nước khử ion lạnh, vô trùng.
- Ly tâm thu tế bào ở 5000 vịng/phút, 4oC trong 10 phót.
- Tế bào được hồ bằng 0,5 ml nước khử ion vơ trùng và chia đều vào các eppendorf, mỗi ống chứa 80 l dịch tế bào dùng cho xung điện.