- Chương trình chạy:
b) Biến nạp bằng xung điện
- Hót 1 l ADN plasmid cho vào 80 l dịch tế bào và đảo nhẹ để ADN phân bè đồng đều.
- Chuyển dịch tế bào có chứa ADN vào trong cuvet xung điện kích thước 2 mm đã được đặt trong lạnh.
- Xung điện ở R=200 , U=2,5 kV, C=25 F trong 4-5 miligiây.
- Bổ sung 500 l môi trường SOC lạnh vào mẫu. Đảo đều lượng mẫu bằng
pipet và chuyển sang eppendorf mới.
- Lắc 200 vịng/phút trong 30 phót ở 37oC.
- Cấy trải 100 l mÉu lên đĩa môi trường LBA và ủ ở 37oC qua đêm.
2.2.6. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ tế bào E. coli
Các hố chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và biến tính các phân tử protein. Khi thay đổi giá trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali axetat, axit axetic, các phân tử protein, ADN hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khái dung dịch bằng ly tâm tốc độ cao. ADN plasmid được tủa lại bằng ethanol. Lượng ARN còn tồn tại trong dung dịch chứa ADN plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung ARNase.
Quy trình:
- Cấy chuyển mét khuẩn lạc của tế bào E. coli vào trong ống nghiệm chứa 2 ml môi trường LBA, ni lắc qua đêm ở 37o, 200vịng/phút.
- Rót 1,5 ml dịch ni cấy vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu tế bào.
- Bổ sung 100 l Sol I, vortex sau đó đặt ở nhiệt độ phịng trong 10 phót. - Bổ sung 200 l Sol II, trộn nhẹ để tránh đứt gẫy ADN, đặt lên đá trong 5 phót.
- Bổ sung tiếp 150 l Sol III, đảo nhẹ 5 lần (không được vortex) và đặt trong đá 10 phót.
- Ly tâm 10 phót với tốc độ 13000 vịng /phót.
- Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf. Bổ sung 450 l dung dịch
phenol/chloroform/isoamylalcohol, trộn thật đều, ly tâm 13000 vịng/phút, 10 phót để loại protein và ADN nhiễm sắc thể.
- Hót pha trên chuyển sang ống eppendorf mới và lặp lại bước trên với 400
l hỗn hợp chloroform/isoamylalcohol (24:1). Bằng cách này, lượng phenol cịn sót
lại sẽ bị loại khỏi dung dịch ADN.
- Ly tâm 13000 vịng/phút trong 10 phót.
- Tủa dịch pha trên với hai lần thể tích cồn 100%, 2 giê ở -70oC. Thu ADN kết tủa trong dung dịch bằng cách ly tâm 13000 vịng/phút, 10 phót. Phần kết tủa
được rửa với cồn 70% và thu lại bằng cách ly tâm 13000 vịng/phút trong 10 phót. Làm khơ tủa bằng máy Speed-Vac, hồ tan ADN plasmid vào 40 l dung dịch TE, bảo quản ở -20oC.
ADN plasmid đã tách được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose 0,8%.
Loại bá ARN có trong mẫu
ARN lẫn trong sản phẩm tách chiết ADN được loại bỏ bằng ARNase. Bổ
sung vào hỗn hợp ADN plasmid một lượng ARNase để đạt nồng độ cuối cùng 100
g/ml, ủ hỗn hợp ở 37oC trong thời gian 30 phót.
2.2.7. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose
Cơ sở lý thuyết:
Các đoạn ADN có khối lượng, hình dạng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Vị trí của ADN trên gel được xác định trực tiếp qua các băng ADN nhờ thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide và phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
Quy trình: