- Chương trình chạy:
3.1.5.2.Kiểm tra bằng enzyme hạn chế Ps t
d) Quan sát và chụp ảnh
3.1.5.2.Kiểm tra bằng enzyme hạn chế Ps t
Song song với việc kiểm tra bằng enzyme hạn chế Sap I, chóng tơi cũng sử dụng Pst I để có kết luận chắc chắn hơn. Phân tích bản đồ enzyme hạn chế của pJET1 và gen as-48 thấy rằng: Trên pJET1 chỉ có một trình tự cắt của Pst I ở vị trí 1036, trên as-48 cịng chỉ có một trình tự cắt ở vị trí 155 nằm trong gen as-48. Như vậy, sau khi cắt plasmid tái tổ hợp pJET1-as48, điện di trên gel agarose 1,7% sẽ cho hai băng ADN, một băng có kích thước khoảng 0,7 bp và một băng có kích thước của phần cịn lại vector pJET1-as48 là khoảng 2,7kb. Sơ đồ và kết quả cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế Pst I được thể hiện ở hình 16.
Trên điện di đồ hình 16B, sản phẩm cắt kiểm tra từ đường chạy số 3-6 cho hai băng với kích thước như tính tốn. Đây chính là bốn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen as-48. Kết quả trên đường chạy sè 1 cho băng có kích thước cao hơn
băng 2,7 kb; chứng tỏ đây là dịng plasmid khơng mang gen as-48 (chính là vector pJET1).
A) B) B)
Hình 16. A. Sơ đồ cắt pJET1-as48 bằng enzyme hạn chế Pst I
B. Kết quả cắt kiểm tra pJET1-as48 bằng enzyme hạn chế Pst I Đường chạy số 1, 3-6: Plasmid tái tổ hợp
Đường chạy số 2: Maker 100 bp (Fermentas)
Với những kết quả thu được như trên có thể khẳng định: Gen as-48 đã được tách dịng thành cơng trong vector pJET1. Tuy nhiên, trong quá trình tiến hành PCR, có thể xẩy ra một số sai sót làm biến đổi thành phần nucleotit của sản phẩm PCR gây đột biến (như đột biến lệch khung đọc, đột biến vô nghĩa), ảnh hưởng đến thành phần sản phẩm protein biểu hiện sau này. Do đó, để xác định chính xác nhất, chúng tơi chọn một dịng plasmid tái tổ hợp đã cắt kiểm tra để đọc trình tù nucleotit và so sánh với trình tù lý thuyết của gen as-48. Kết quả đọc và so sánh trình tự được trình bày ở hình 17. 1 2 3 4 5 6 2,7 kb 0,7 kb 3,4 kb as-48 Pst I (1036) Pst I (155-as48) Cloning site(497-498) Pst I Một phần gen as-48+ một
phần của vector (~0,7 kb) Phần cịn lại của vector (~2,7 kb)
A)
B)
Hình 17. A) Phổ đọc trình tự với gen as-48
B) Kết quả so sánh trình tự gen đã đọc với gen as-48 lý thuyết Query: Trình tự nucleotit của gen as-48 lý thuyết
Sbjct : Trình tự gen đã đọc
Kết quả so sánh trình tự ADN trên hình 17B đã chứng minh, trình tự nucleotit của gen ngoại lai hồn tồn tương đồng với trình tù gen as-48 lý thuyết.
Kết quả này cho phép khẳng định, gen as-48 đã được tách dịng thành cơng và có
thể sử dông để thiết lập hệ vector biểu hiện.
Query 14 GGTGGTTGCTCTTCCGCACCAAGCAATAACTGCTCTTTTTCCTTTTTTCTAAATTTCTT 72 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 270 GGTGGTTGCTCTTCCGCACCAAGCAATAACTGCTCTTTTTCCTTTTTTCTTAATTTCTT 212 Query 73 TCTTAAGGTATGCTTTAATTGACTCTCTTCCTGCTGCAGCAAGTAAAGAAAGACCTCCA 131 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 211 TCTTAAGGTATGCTTTAATTGACTCTCTTCCTGCTGCAGCAAGTAAAGAAAGACCTCCA 153 Query 132 CTACCTACAGCAGTAAGAATTGAAACAATAGTAGTGACCCATCCACCAGCTTCAACTACA 191 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 152 CTACCTACAGCAGTAAGAATTGAAACAATAGTAGTGACCCATCCACCAGCTTCAACTACA 93 Query 192 TTAAGCACAGTTCCTGCAACTGCTGCTGGTATACCGAACTCTTTAGCCATATGTGCAATT 251 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 92 TTAAGCACAGTTCCTGCAACTGCTGCTGGTATACCGAACTCTTTAGCCATATGTGCAATT 33 Query 252 GGCAAAAACTGAAGGTTGGAAGAGCAACCACC 283 |||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 32 GGCAAAAACTGAAGGTTGGAAGAGCAACCACC 1
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pTWIN
Vector pJET1 chỉ được thiết kế cho mục đích tách dịng, hồn tồn khơng có khả năng biểu hiện protein ngoại lai. Do đó, chúng tơi tiến hành chuyển gen as-48
sang vector biểu hiện. Như đã đề cập ở phần tổng quan, enterocin AS-48 là một peptit vòng, việc biểu hiện protein cần có sự tạo thành liên kết peptit nội phân tử giữa hai axit amin đầu-cuối. Chỉ khi tồn tại ở cấu trúc dạng vịng thì AS-48 mới có hoạt tính kháng khuẩn. Do đó, việc lùa chọn hệ vector biểu hiện thích hợp là vấn đề mang tính cốt lõi. pTWIN là hệ vector được thiết kế tối ưu cho việc biểu hiện protein vòng sử dụng hai đầu intein dung hợp vùng có ái lực cao với chitin (CBD). Gen as-48 được thiết kế cài xen vào giữa hai đầu intein, protein tái tổ hợp sau khi
biểu hiện sẽ được tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên cột có chứa hạt chitin. Nhờ các điều kiện phân cắt bởi pH và DTT, hai đầu intein sẽ bị giữ lại trên cột thơng qua CBD, protein hình thành liên kết peptit tạo phân tử dạng vịng và giải phóng ra khỏi cột tinh sạch. Trong bé sinh phẩm biểu hiện và tinh sạch protein dạng vịng của hãng BioLabs có hai hệ vector pTWIN1 và pTWIN2. Hai hệ vector này có cấu trúc khá giống nhau. Điểm khác biệt cơ bản là intein2 dung hợp với protein biểu hiện ở đầu C của hai hệ vector khác nhau. Chính điều này sẽ dẫn đến khả năng biểu hiện và tinh sạch của protein tái tổ hợp khác nhau. Do đó, chúng tơi đã tiến hành biểu hiện đồng thời gen as-48 trên hai hệ vector để xác định hệ vector tối ưu cho quá
trình biểu hiện.