- Chương trình chạy:
d) Quan sát và chụp ảnh
3.1.4. Tách plasmid tái tổ hợp từ các thể biến nạp
Tiến hành nuôi lắc qua đêm các tế bào chọn ngẫu nhiên trong 2 ml LBA lỏng ở 37oC. Tách chiết ADN plasmid theo phương pháp phân giải kiềm. 3 l sản phẩm tách ADN plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả như hình 14.
ADN plasmid thường tồn tại dưới hai dạng: Siêu xoắn (supercoil) và dạng giãn xoắn (necked). Trong đó, dạng siêu xoắn có kích thước bé, dễ len lái, nên di chuyển nhanh nhất theo điện trường. Như vậy, khi phân tách trên gel agarose, sản phẩm tách plasmid thường xuất hiện một đến hai băng tùy thuộc vào trạng thái của plasmid. Vector pJET1 có kích thước là khoảng 3,1 kb (3128 bp), đoạn ADN ngoại lai có kích thước khoảng 0,23 kb (234 bp), nên vector tái tổ hợp có kích thước khoảng 3,4 kb (3362 bp). Theo nguyên lý điện di, các plasmid tái tổ hợp có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển chậm so với plasmid khơng mang gen.
Hình 14. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid từ các thể biến nạp trên gel agarose 0,8%
Đường chạy số 1-6: plasmid từ các thể biến nạp
Trong thí nghiệm thực hiện với vector tách dòng pJET1, các plasmid nếu không được cài gen ngoại lai, gen eco47IR sẽ biểu hiện gây chết tế bào. Do đó, kết quả tách plasmid này khơng có mẫu đối chứng. Theo lý thuyết, tất cả đều là các plasmid từ các thể biến nạp. Nhưng theo như kết quả hình 14 cho thấy: ADN plasmid từ đường chạy số 2 đến số 6 có vị trí cao hơn so với đường chạy số 1. Đây là một căn cứ để khẳng định ADN plasmid từ các dịng tế bào này đã có gen ngoại lai chèn vào. Trong khi đó, ADN plasmid ở đường chạy số 1 đã khơng có gen chèn vào nên có kích thước bé hơn (có thể là vector pJET1). Trường hợp dòng tế bào mang plasmid này vẫn thoát khỏi sự chọn lọc của gen eco47IR có thể do một đoạn ADN kích thước nhỏ bắt nguồn từ sản phẩm PCR khơng đặc hiệu hoặc do đứt gẫy từ các đoạn ADN khác có kích thước lớn hơn nối ghép vào vector.
Để khẳng định các dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen as-48, chóng tơi tiến
hành cắt kiểm tra các dòng ADN plasmid từ đường chạy số 2 đến số 6 bằng các enzyme hạn chế là Sap I và Pst I.