- Chương trình chạy:
d) Quan sát và chụp ảnh
3.1.1. Phân lập gen as-48 bằng PCR tự mồ
Do khơng có chủng vi khuẩn chứa gen as-48, quá trình phân lập phải tiến
hành qua hai giai đoạn chính. Giai đoạn 1 sử dụng PCR tự mồi (PCR1): Dựa trên trình tự ADN đã được công bố trên ngân hàng Gen quốc tế, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi dài xuôi và ngược (đoạn oligo nucleotit) sử dụng để tổng hợp gen as-48 mà khơng cần trình tự khn. Để thu được sản phẩm ADN đủ điều kiện cho tách dịng, chúng tơi tiếp tục tiến hành giai đoạn 2 bằng PCR bình thường (PCR2). Phản ứng này được thực hiện bằng cách thiết kế thêm cặp mồi ngắn nhằm sử dụng chính sản phẩm ADN của giai đoạn 1 làm khuôn.
Gen as-48 được xác định trình tự gồm 234 bp. Trong giai đoạn 1, cặp mồi
dài được thiết kế phải đảm bảo tương ứng với trình tự ADN đã cơng bố và tổng hợp được gen đúng kích thước. Nhưng cặp mồi cũng khơng được thiết kế quá dài, bởi với những đoạn oligo nucleotit dài sẽ có sai sót trong tổng hợp nhân tạo. Mặt khác, để đảm bảo các đoạn oligo nucleotit bắt cặp với nhau trong PCR tự mồi thì cặp mồi dài bắt buộc phải có trình tự gối lên nhau. Độ dài trình tự này thường là trên 18 nucleotit mới giúp cho sự bắt cặp chính xác của hai đoạn oligo nucleotit. Ngồi ra, để thuận tiện trong tạo dòng và biểu hiện gen về sau, cặp mồi phải chứa trình tự nhận biết của enzyme hạn chế thích hợp có trong vùng đa điểm cắt của các vector sử dụng.
Gen as-48 được chọn dòng trong vector pJET1 và biểu hiện nhờ hệ vector
pTWIN. Do đó, cặp mồi ngắn đặc hiệu dùng trong giai đoạn 2 phải đảm bảo các tiêu chuẩn sau:
- Giữ nguyên chiều dài của đoạn gen tự nhiên mã hóa cho AS-48 (khơng có đoạn peptit tín hiệu).
- Chứa điểm cắt của enzyme hạn chế nằm trong vùng đa điểm cắt của vector biểu hiện pTWIN. Những điểm cắt này phải nằm ngay sát đầu tận cùng của đoạn gen và xuôi chiều với promoter T7 của vector biểu hiện.
- Giữ đúng khung đọc của gen as-48 trong tự nhiên sau khi đưa vào vector
biểu hiện pTWIN.
Sau khi phân tích trình tự cắt của các enzyme hạn chế trên gen và vùng đa điểm cắt của pTWIN, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzyme hạn chế Sap I thỏa mãn điều kiện: Khơng có trong trình tự của gen as-48, có mặt trong vùng đa
điểm cắt của vector pTWIN (nằm ở hai đầu). Do đó, khi thiết kế mồi cho PCR, chúng tơi đưa thêm trình tự nhận biết của Sap I vào nhằm mục đích nhân được đoạn gen có mang trình tự này ở hai đầu. Việc thiết kế này không những đảm bảo cho việc nối ghép gen as-48 vào vector pTWIN sau này được thuận lợi mà còn định
hướng đúng khung đọc mở của gen với khung đọc mở trên pTWIN.
Hai cặp mồi trong q trình phân lập gen as-48 có trình tự như sau:
Giai đoạn 1: PCR tự mồi sử dụng cặp mồi dài oligo nucleotit với trình tự ADN được gối lên nhau (147 và 141 nucleotit).
As48 R/Sap I: 5’- GGT GGT TGC TCT TCC GCA CCA AGC AAT AAC TGC TCT TTT TCC TTT TTT CTT AAT TTC TTT CTT AAG GTA TGC TTT AAT TGA CTC TCT TCC TGC TGC AGC AAG TAA AGA AAG ACC TCC ACT ACC TAC AGC AGT AAG AAT TGA AAC AAT -3’
As48 F/Sap I: 5’- GGT GGT TGC TCT TCC AAC CTT CAG TTT TTG CCA ATT GCA CAT ATG GCT AAA GAG TTC GGT ATA CCA GCA GCA
GTT GCA GGA ACT GTG CTT AAT GTA GTT GAA GCT GGT GGA TGG GTC ACT ACT ATT GTT TCA ATT CTT ACT - 3’
Giai đoạn 2: PCR bình thường, sử dụng mẫu là sản phẩm của giai đoạn 1 As48 R/Sap I: 5’- GGT GGT TGC TCT TCC GCA CCA AGC A -3’ As-48 F/Sap I: 5’- GGT GGT TGC TCT TCC ACC CTT CGA T - 3’
Trong PCR, trình tự đoạn mồi có vai trị quan trọng nhất để đạt hiệu quả trong nhân gen mong muốn. Với cặp mồi dài đã thiết kế cho thấy:
- Có một trình tự 18 nucleotit gối lên nhau giữa hai mồi, cho phép sự bắt cặp bổ sung giữa hai đoạn oligo nucleotit, đảm bảo sự liên kết một cách tương đối giữa hai đoạn.
- Chiều dài của mồi xuôi và mồi ngược tương ứng là 147 và 141 nucleotit, đảm bảo tổng hợp đúng kích thước của gen as-48.
- Nhiệt độ gắn mồi của hai mồi gần nh- bằng nhau, là 71,6o
C và 71,8oC.
- Thành phần nucleotit của hai mồi đặc trưng cho trình tự gen as-48.
- Hỗn hợp sản phẩm PCR là các đoạn ADN có trình tự nhận biết của enzyme hạn chế Sap I ở hai đầu.
Với cặp mồi ngắn được thiết kế đặc hiệu trong PCR2 cho thấy:
- Khơng có sự bắt cặp giữa mồi xi và mồi ngược, khơng có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các đoạn khác nhau của cùng một mồi.
- Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược tương ứng là 61,2oC và 65,7oC, không khác biệt nhau quá nhiều.
- Thành phần nucleotit của hai mồi Ýt cặp GC lặp lại và đặc trưng cho trình tự ADN cần nhân lên.
- Sản phẩm PCR sẽ là một đoạn gen mà hai đầu có thêm trình tự nhận biết của enzyme hạn chế Sap I.
Kết quả của quá trình tổng hợp gen as-48 được điện di kiểm tra trên gel
agarose 1,7% (hình 13):
Hình 13. Kết quả kiểm tra sản phẩm tổng hợp gen as-48 trên gel agrose 1,7 %
Đường chạy số 1, 4: Maker 100 bp (Fermentas) Đường chạy số 2: Sản phẩm PCR tự mồi Đường chạy số 3: Sản phẩm PCR bình thường
Kết quả kiểm tra sản phẩm tổng hợp gen as-48 trên điện di đồ cho thấy: Sản phẩm PCR tự mồi với cặp mồi dài (đường chạy số 2) cho một dải ADN kéo dài từ 80-400 bp thể hiện sản phẩm của PCR1 là hỗn hợp của nhiều đoạn ADN có kích thước khác nhau. Đặc biệt, trong vùng kích thước tương ứng với gen as-48, nồng độ ADN là khá lớn. Điều này chứng tỏ, ngồi những đoạn ADN khơng đặc hiệu, sản phẩm của PCR tự mồi cịn có cả đoạn đặc hiệu cho gen. Do đó, sản phẩm này được sử dụng trực tiếp làm mẫu trong PCR giai đoạn 2 cho kết quả ở đường chạy số 3. Kết quả trên đường chạy số 3 là băng ADN khá đặc hiệu với kích thước tương ứng với kích thước mong muốn (khoảng 0,23 kb). Với kết quả này, sản phẩm PCR của giai đoạn 2 đủ điều kiện để sử dụng cho các bước tiếp theo.