Bước đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện thịt heo và thịt bò trong thực phẩm dựa trên gen Cytochrome - B

Kỹ thuật PCR ngày càng được sử dụng phổ biến trong những nghiên cứu về phát hiện các loại mô động vật bằng phản ứng khuếch đại những trình tự DNA mong muốn. Ứng dụng phương pháp PCR, bước đầu chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân biệt thịt heo và thịt bò bằng kỹ thuật multiplex PCR (m-PCR) dựa trên sự khuếch đại gen Cytochrome - B bằng các cặp mồi đặc hiệu.

Kỷ yếu hội thảo khoa học – Phân ban công nghệ thực phẩm BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN THỊT HEO VÀ THỊT BÒ TRONG THỰC PHẨM DỰA TRÊN GEN CYTOCHROME - B Nguyễn Thị Kim Oanh1, Lê Khánh Linh1, Nguyễn Thị Phương Thảo1, Nguyễn Thị Nết1,* Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh *Email: netnguyen1120@gmail.com Ngày nhận bài: 15/6/2017; Ngày chấp nhận đăng: 2/7/2017 TÓM TẮT Kỹ thuật PCR ngày sử dụng phổ biến nghiên cứu phát loại mô động vật phản ứng khuếch đại trình tự DNA mong muốn Ứng dụng phương pháp PCR, bước đầu nghiên cứu xây dựng thành cơng quy trình phân biệt thịt heo thịt bị kỹ thuật multiplex PCR (m-PCR) dựa khuếch đại gen Cytochrome - B cặp mồi đặc hiệu Các thơng số tối ưu cho quy trình gồm: nhiệt độ bắt cặp cặp mồi DNA khn quy trình khuếch đại DNA để phân biệt thịt heo thịt bị mPCR 59ºC, nờ ng đô ̣ tối ưu cặp mồ i 0,4µM độ nhạy phương pháp 0,1ng/µl Chúng tơi ứng dụng quy trình m-PCRtrên 12 mẫu đồ hộp thịt bị dán nhãn khơng có thịt heo Kết qúa trình khảo sát ghi nhận có mẫu đồ hộp có thành phần thịt heo (33,33%), mẫu cịn lại khơng có thành phần thịt heo (66,67%) Vì vậy, quy trình có đủ sở khoa học để triển khai số loại thực phẩm chế biến từ thịt bò khác, với lượng mẫu lớn Từ khóa: multiplex PCR, phát hiện, thịt heo, thịt bò, Cytochrome - B GIỚI THIỆU Xác định loài động vật sản phẩm thịt vấn đề quan trọng việc bảo vệ người tiêu dùng khỏi pha trộn bất hợp pháp khơng mong muốn, lý kinh tế, tơn giáo y tế [1] Vì thế, việc phát triển ứng dụng phương pháp phát nhanh xác loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm cần thiết [2] Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ hay nhiều loại thịt khác Do đa dạng hình thức, chất lượng giá thành sản phẩm thịt chế biến gây vấn đề gian lận thương mại Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt thành phần nhãn hiệu, công thức chế biến lệch với thực tế nhằm nâng cao giá trị cho sản phẩm Đặc biệt, gian lận ảnh hưởng đến việc kiêng sử dụng hay vài loại thịt lý sức khỏe (ví dụ bị dị ứng) hay lý tơn giáo (ví dụ, đạo Hindu khơng ăn thịt bị, đạo Hồi đạo Do Thái khơng ăn thịt heo) [2] Những đổi gần cơng nghệ đóng gói sản phẩm làm cho việc xác 268 Nguyễn Thị Kim Oanh, Lê Khánh Linh, Nguyễn Thị Nết, Nguyễn Thị Phương Thảo định thành phần thực phẩm dựa thuộc tính vật lý khó khơng thể xác định [3], [4] Các kế hoạch xác định thịt có sẵn dựa công thức sinh học lipid, protein nucleic acid [5] Các phương pháp phát dựa vào protein chậm ứng dụng cho sản phẩm thịt xử lý nhiệt, protein sinh học dễ biến đổi tác động mạnh yếu tố hóa lý loại lượng chất béo (lipid biomarkers) thay đổi q trình chế biến thực phẩm [6], [7] Mặt khác, DNA sinh học ổn định theo điều kiện khác nhau, phương pháp dựa vào DNA thường sử dụng hơn, đặc biệt phương pháp PCR đặc trưng cho lồi [6], [8] Trong đó, phương pháp Realtime PCR, PCR – RFLP, PCR sequencing, PCR – SSCP địi hỏi máy móc, trang thiết bị, hóa chất phức tạp, giá thành cao, phương pháp m-PCR dễ thực nên sử dụng rộng rãi việc phân biệt loài thịt [6] Trong phương pháp m-PCR, trình tự gen Cytochrome-B sử dụng rộng rãi nghiên cứu phát loài, khoa học pháp y kiểm tra thực phẩm Đây khu vực gen bảo tồn chứa thơng tin cụ thể lồi gen chức nằm gen chịu trách nhiệm sản sinh tRNAGlu tRNAThr mã hóa phần enzyme Cytochrome – C xúc tác cho phản ứng oxi hóa khử, enzyme phức hợp trình phosphoryl oxy hóa [9] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất Hóa chất dùng chotách chiết DNA, phương pháp PCR điện di cung cấp công ty Top Biotechnology Research (TBR) 2.2 Mồi phản ứng khuếch đại PCR Các cặp mồi nhân DNA bò heo tham khảo từ nghiên cứu trước Một cặp mồi chung F R dùng để phát loại thịt có nguồn gốc động vật, hai mồi P R CR đặc hiệu cho thịt heo bò tương ứng [10], [11] Chi tiết trình tự cặp mồi trình bày bảng Tất mồi sử dụng nghiên cứu đượctổng hợp Integrated DNA Technologies (IDT) - Hoa Kỳ Bảng Các mồi sử dụng nghiên cứu Kích thước đoạn khuếch đại Vị trí 609 bp 168-776 GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA 288bp 168-455 CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG 164bp 168-331 Trình tự (5’ – 3’) TT Tên F ATCCGACACAACAACAGCATTCTCCT R GCTGGGGTGTAGTTGTCTGGGTCTC PR CR 2.3 Phương pháp 2.3.1 Thu thập mẫu 269 Bước đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát thịt heo thịt bò thực phẩm Mẫu chứng dương bao gồm mẫu động vật thịt bị thịt heo Mẫu chứng âm mẫu tơm, mực, cá, gà Mẫu thực tế mẫu đồ hộp thịt bò thu mua ngẫu nhiên từ hãng sản xuất khác cửa hàng, siêu thị địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh 2.3.2 Tách chiết DNA Phương pháp tách cột: Bước - Thu mẫu: Lấy 30mg mẫu thịt cho vào eppendorf 1,5ml Bước - Ly giải mẫu: Cho 350μl dung dịch LB vào eppendorf 1,5ml thu cặn tế bào Lắc Cho tiếp 10μl protein K vào, lắc nhẹ ủ 56ºC 60 phút đến tế bào ly giải hoàn toàn Lưu ý: Lắc thường xuyên thời gian ủ (khoảng -10 phút) Bước - Gắn DNA lên cột: Cho 350μl Isopropanol vào, đảo để nhiệt độ phịng 1-2 phút Có thể ly tâm tốc độ thấp để lắng bớt cặn tế bào (khoảng 4000xg 10s) Chuyển toàn dung dịch eppendorf vào cột silica Ly tâm 11000xg phút Đổ bỏ dịch lọc qua, tái sử dụng ống chứa dung dịch (phía cột silica) giữ lại cột silica Lưu ý: DNA lúc gắn vào silica bên cột Bước - Rửa cột lần 1: Cho 600μl WB1 vào cột silica Ly tâm 11000xg phút Đổ bỏ dịch lọc qua, tái sử dụng ống chứa dung dịch (phía cột silica) giữ lại cột silica Bước 5- Rửa cột lần 2: Cho 600μl WB2 vào cột silica Ly tâm 11000xg phút Đổ bỏ dịch lọc qua, tái sử dụng ống chứa dung dịch (phía cột silica) giữ lại cột silica Bước 6: Làm khô cột silica Ly tâm 11000xg phút Bỏ ống chứa dung dịch (phía cột silica) giữ lại cột silica Bước 7: Thu DNA: Chuyển cột silica vào eppendorf 1,5ml Cho 100μl dung dịch EB (đã ủ 70ºC) vào cột silica Ly tâm 11000xg phút Giữ eppendorf 1,5ml bảo quản -20ºC chưa sử dụng Phương pháp tách nhanh: Bước - Thu mẫu: Lấy 30mg mẫu thịt cho vào eppendorf 1,5ml Bước - Ly giải mẫu: Cho tiếp 10μl protein K vào Cho 350μl dung dịch LB vào eppendorf 1,5ml thu cặn tế bào Lắc Ủ 70ºC 30 phút 95ºC 10 phút Lưu ý: Lắc thường xuyên thời gian ủ (khoảng -10 phút) Trước đem thực phản ứng PCR mẫu pha loãng với tỷ lệ 1:10 (Pha loãng 20μl mẫu với 180μl nước) 2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng m-PCR Các mồi sử dụng nghiên cứu tham khảo từ báo khoa học trước tiến hành điều kiện phản ứng khác với điều kiện thực tế Việt Nam Vì vậy, chúng tơi tiến hành phân tích, khảo sát đặc tính, thơng số vật lý tính đặc hiệu cặp mồi để tối ưu hóa thơng số phù hợp với điều kiện thực tiễn Để kiểm tra chuyên biệt cặp mồi, tiến hành đặt phản ứng monoplex PCR với DNA hai mẫu chứng dương đại diện cho cặp mồi thịt bò thịt heo phản ứng multiplex PCR với DNA mẫu chứng dương đồng thời hai loại thịt Kiểm tra tượng ngoại nhiễm mẫu chứng âm với thành phần phản ứng khơng đổi thay nguồn DNA hai lồi thành DNA lồi khác (tơm, mực, cá, gà) Thành phần phản ứng m-PCR: Tất thí nghiệm khuếch đại phản ứng m-PCR thực với dung tích phản ứng 25µl, thành phần sau: 12,5µlMyTaq Mix (5mM dNTP, 15mM MgCl2 Taq polymerase); 1µl mồi 0,4M (10 pmol cho mồi); 5µlmỗi DNA khn; thêm nước cất cho đủ thể tích 25µl Chương trình phản ứng m-PCR: Tiền biến tính chuỗi DNA 95ºC 1phút, sau thực 35 chu kỳ phản ứng nhiệt, chu kỳ nhiệt gồm: biến tính 95ºC 15 giây, bắt cặp nhiệt độ tương ứng cho cặp mồi khảo sát 15 giây, kéo dài 72ºC 10 giây 270 Nguyễn Thị Kim Oanh, Lê Khánh Linh, Nguyễn Thị Nết, Nguyễn Thị Phương Thảo Phân tích sản phẩm: Điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% với chất nhuộm GelRed kết hình ảnh ghi nhận máy Gel.doc 2.3.4 Kiểm tra độ tinh sản phẩm m-PCR Chúng sử dụng phương pháp đo quang phổ để tiến hành xác định hàm lượng kiểm tra độ tinh khiết phân tử DNA có dung dịch mẫu sau q trình m-PCR Phương pháp dựa vào hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm base Purine Pyrimidine, độ hấp thụ tỷ lệ với nồng độ DNA Dựa vào tính chất này, xác định hàm lượng nucleic acid phương pháp đo quang phổ hấp thụ bước sóng 260nm (OD260nm) Để đánh giá độ tinh dung dịch DNA, tiến hành đo dung dịch bước sóng 280nm mức hấp thụ cực đại protein, protein hấp thụ ánh sáng bước sóng 260nm nucleic acid làm sai lệch giá trị thật nồng độ acid nucleic Phương pháp tính nồng độ DNA: Các trình tự nucleotide (DNA, RNA Oligo) có nồng độ khác có khả hấp thu ánh sáng bước sóng khác Khi bước sóng 260nm, độ hấp thụ ánh sáng nồng độ acid nucleic tính sau: C = A/(e * l) Trong C: nồng độ acid nucleic (μg/ml) A: Độ hấp thụ (giá trị OD260) l: chiều rộng cuvette dùng để giữ dung dịch, cm, thường 1cm e: Hệ số pha loãng DNA, RNA oligo với: e (OD260)= 50ug/ml (đối với DNA mạch kép) Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2,0 xem dịch chiết DNA tinh Nếu giá trị thấp hơn, cần xem xét nhiễm protein KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết kiểm tra lý thuyết đặc tính cặp mồi Các đặc tính vật lý mồi (nhiệt độ nóng chảy, kích thước, thành phần GC…) đánh giá phần mềm IDT Kết kiểm tra cho thấy giá trị vật lý chiều dài, %GC, nhiệt độ nóng chảy chênh lệch nhiệt độ nóng chảy thỏa mãn yêu cầu thiết kế mồi Về ΔG thỏa mãn lớn -9 kcal.mole-1 (Kết khơng trình bày) Tính đặc hiệu mồi tiến hành kiểm tra chương trình BLAST Annhyb cho thấy khả bắt cặp đặc hiệu Cytochrome - B loài heo bị với mức độ tương đồng đạt 100% khơng bắt cặp trình tự Cytochrome - B loài động vật khác Đồng thời kiểm tra phần mềm ClustalX, kết cho thấy cặp mồi đặc hiệu với trình tự Cytochrome - B từ heo bị (kết khơng trình bày) Dựa kết thu nhận được, cặp mồi chọn để sử dụng cho thực nghiệm sau 3.2 Xây dựng quy trình m-PCR Sáu mẫu thực nghiệm (bị, heo, gà, tơm, cá, mực) tách chiết theo phương pháp cột hãng Bioline Kết tách chiết kiểm tra giá trị OD tỷ số OD260/OD280 (bảng 2) 271 Bước đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát thịt heo thịt bị thực phẩm Bảng Giá trị OD tỷ số A260/A280 mẫu tách chiết Mẫu OD260 OD260/OD280 CDNA (µg/ml) Bị 0,55 1,98 27,3 Heo 0,27 2,0 13,3 Gà 2,38 2,0 119,1 Cá 0,4 2,05 19,9 Tôm 0,21 1,98 10,3 Mực 0,42 2,02 21,1 Giá trị OD260/OD280 mẫu tách có giá trị nằm khoảng 1,8 đến 2,0 Điều có nghĩa sản phẩm tách chiết DNA mẫu không bị nhiễm protein Bảng Đánh giá tính chuyên biệt cặp mồi sử dụng nghiên cứu Mồi Mẫu F+R F + PR F + CR Heo + + - Bị + - + Gà + - - Tơm - - - Cá - - - Mực - - - Kết nghiên cứu khảo sát tính chuyên biệt điều kiện phản ứng đơn mồi cặp mồi F, R, PR, CRcho thấy cặp mồi sử dụng nghiên cứu chuyên biệt cho đối tượng DNAcủa heo bị Hình Khảo sát độ đặc hiệucủa mồi Giếng 1: DNA cá, tôm, mực, gà; giếng 2: DNA tôm; giếng 3: DNA cá; giếng 4: DNA mực; giếng 5: Thang DNA; giếng 6: DNA gà; giếng 7: DNA heo; giếng 8: DNA bò; giếng 9: DNA heo+bò; giếng 10: nước cất 272 Nguyễn Thị Kim Oanh, Lê Khánh Linh, Nguyễn Thị Nết, Nguyễn Thị Phương Thảo Phản ứng m-PCR đươ ̣c tiế n hành sau chúng đã thử nghiệm thành công phản ứng đơn mồi Kết khuếch đại trình bày hình cho thấ y xuấ t hiê ̣n va ̣ch sản phẩ m với kić h thước mong đợi vạch heo 288bp, vạch bò 164bp vạch sản phẩm động vật 609bp phù hợp với kết khảo sát lý thuyết Như vâ ̣y có thể kế t luâ ̣n về sự bắ t că ̣p hiê ̣u quả và đă ̣c hiê ̣u của các mồ i DNA triǹ h tự đích các phản ứng monoplex và m-PCR Từ đây, chúng tơi tối ưu hóa hai thơng số nồng độ cặp mồi nhiệt độ lai phản ứng m-PCR Kết khảo sát nhiệt độ cho phép xác định nhiệt độ lai để khuếch đại đồng thời DNA heo DNA bò m-PCR 59ºC kết khảo sát nồng độ mồi cặp mồi tối ưu 0,4µM (kết khơng trình bày) 3.3 Độ nhạy phương pháp m-PCR Hình Kết m-PCR từ hỗn hợp DNA heo bò nồng độ khác Giếng 1: Thang chuẩ n 100 bp; Giếng 2: 10ng/µl; giếng 3: 1ng/µl; giếng 4: 0,1ng/µl; giếng 5: 0,01ng/µl; giếng 6: 0,001ng/µl Độ nhạy m-PCR xác định cách sử dụng hỗn hợp DNA heo bị có nồng độ 10ng/µl, pha lỗng bậc 10 đến nồng độ thấp 0,001ng/µl Kết hình cho thấy, tín hiệu dương tính ổn định nồng độ 0,1ng/µl Như vậy, việc tách chiết DNA sử dụng 2µl DNA cho phản ứng m-PCR để xác định độ nhạy phương pháp m-PCR phát DNA heo bị 0,1ng/µl Năm 2014, Abdul Hassan Tauma sử dụng phương pháp m-PCR để xác định số loại thịt dựa gen Mitochondrial Cytochrome - B, tác giả xây dựng thành công phương pháp kiểm tra nhanh, dễ dàng đáng tin cậy để kiểm soát sản phẩm thịt bị pha trộn Kết nghiên cứu cho thấy độ nhạy quy trình ≤ 1µg/µl DNA [10] Từ kết lý thuyết thực nghiệm cho thấy, bước đầu thành công việc xây dựng quy trình thực nghiệm khuếch đại gen Cytochrome - B nhằm mục đích phát thịt heo diện sản phẩm thực phẩm chế biến từ thịt bị 3.4 Kết thử nghiệm quy trình m-PCR mẫu thực tế Thử nghiệm 12 mẫu đồ hộp thịt bò hãng sản xuất khác khác ngày sản xuất thu mua từ cửa hàng, siêu thị địa bàn TP HCM với thành phần ghi nhãn 273 Bước đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát thịt heo thịt bị thực phẩm bao bì khơng chứa thịt heo Chúng tiến hành tách chiết DNA từ mẫu đồ hộp thịt bò phương pháp tách chiết cột tách chiết nhanh 609 bp 600bp 288 bp 300bp 164 bp 200bp Hình Kết khảo sát 12 mẫu đồ hộp thịt bò sử dụng phương pháp tách chiết cột Giếng 1-12: mẫu đồ hộp thịt bò, giếng 13: thang chuẩn 609 bp 600bp 288 bp 300bp 200bp 164 bp Đối với phương pháp tách cột, kết điện di thể hình 3cho thấycó mẫu đồ Hình Kết khảo sát 12 mẫu đồ hộp thịt bò sử dụng phương pháp tách chiết nhanh Giếng 1-12: mẫu đồ hộp thịt bò, giếng 13: thang chuẩn hộp thịt bò (33,33%) có thành phần thịt heo (gồm mẫu giếng 1, giếng 2, giếng giếng 5) thành phần ghi nhãn bao bì khơng chứa thịt heo, mẫu đồ hộp thịt bị (66,67%) khơng phát có thành phần thịt heo Đối với phương pháp tách nhanh (hình 4)cũng cho kết mẫu có thành phần thịt heo mẫu không phát thành phần thịt heo tương tự với kết sử dụng phương pháp tách cột, nhiên có xuất vạch ký sinh chứng tỏ sản phẩm DNA bị tạp nhiễm điều không ảnh hưởng đến kết thí nghiệm Độ sáng khơng đồng vạch điện di nồng độ DNA hàm lượng protein động vật nhiễm mẫu tách chiết khơng giống nhau, khuếch đại vạch điện di có độ sáng khác 274 Nguyễn Thị Kim Oanh, Lê Khánh Linh, Nguyễn Thị Nết, Nguyễn Thị Phương Thảo Phương pháp tách chiết cột cho độ tinh DNA cao phương pháp tách chiết nhanh, nhiên tách chiết cột lại tốn nhiều thời gian, hóa chất Đối với nghiên cứu nhằm phát thành phần loại thịt, độ tinh mẫu DNA khơng ảnh hưởng nhiều đến kết định tính, vậy, sử dụng phương pháp tách chiết nhanh rút ngắn thời gian kiểm tra cho kết đáng tin cậy KẾT LUẬN Nghiên cứu cho thấy đặc hiệu cặp mồi dùng để phát DNA heo bò, nhiệt độ lai mồi DNA khuôn 59ºC; nồng độ mồi 0,4µM độ nhạy quy trình mPCR 0,1ng/µl Qua khảo sát 12 mẫu thực tế, kết cho thấy kỹ thuật m-PCR phát triển thành phương pháp kiểm tra nhanh để phát thịt heo trộn lẫn với thịt bò sản phẩm thực phẩm chế biến từ thịt bò TÀI LIỆU THAM KHẢO Meyer, R., Hofelein, C., Luthy, J., & Candrian, U - Polymerase chain reaction– restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method for species identification in food, Journal of AOAC International, 78 (1995) 1542-1551 Đoàn Thị Tuyết Lê Nguyễn Ngọc Tuân - Phân biệt thịt trâu thịt bị kỹ thuật PCR, Tạp chí NN&PTNT (8) (2012) 71-77 Ali, M E., Hashim, U., Mustafa, S., & Che Man, Y B - Swine-specific PCR-RFLPassay targeting mitochondrial Cytochrome B gene for semiquantitativedetection of pork in commercial meat products, Food Analytical Methods, (3) (2011) 613-623 Bottero, M T., & Dalmasso, A - Animal species identification in food products:Evolution of biomolecular methods, The Veterinary Journal, 190 (1) (2011) 34-38 Rahman, M M., Ali, M E., Hamid, S B., Mustafa, S., Hashim, U., & Hanapi, U K.Polymerase chain reaction assay targeting Cytochrome B gene for thedetection of dog meat adulteration in meatball formulation, Meat Science, 97 (4) (2014) 404-409 Đoàn Thị Tuyết Lê Nguyễn Ngọc Tuân - Phân biệt thịt dê, gà, cừu, heo,bị, trâu kỹ thuật multiplex PCR, Tạp chí chăn nuôi (11) (2010) 29-35 Ali, M E., Hashim, U., Mustafa, S., Che Man, Y B., Dhahi, T S., Kashif, M., et al Analysis of pork adulteration in commercial meatballs targeting porcine-specific mitochondrial Cytochrome B gene by TaqMan probe real-timepolymerase chain reaction, Meat Science, 91 (4) (2012) 454-459 Hou, B., Meng, X., Zhang, L., Guo, J., Li, S., & Jin, H - Development of a sensitiveand specific multiplex PCR method for the simultaneous detection of chicken,duck and goose DNA in meat products, Meat Science, 101 (C) (2014) 90-94 Leonard, J.V A H V Schapira - Mitochondrial respiratory chain disorders I: Mitochondrial DNA defects, The Lancet, 355 (2000) 299 – 304 10 Abdul-Hanssan, I.A and Tauma, J.A - Identification of some meat species using PCR and Multiplex PCR of Mitochondrial Cytochrome B Gene, Iraqi Poultry Sci J (1) (2014) 1-9 275 Bước đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát thịt heo thịt bò thực phẩm 11 Deepak Kumar, S P Singh, Nagappa S Karabasanavar, Rashmi Singh, V Umapathi Authentication of beef, carabeef, chevon, mutton and pork by a PCR-RFLP assay of mitochondrial cytb gene, J Food Sci Technol (2012) ABSTRACT THE FIRST STEP IN ESTABLISHING THE MULTIPLEX PCR PROCESS DETECTED PORK AND BEEF IN PROCESSED FOOD BASED ON CYTOCHROME - B GENE Nguyen Thi Kim Oanh, Le Khanh Linh, Nguyen Thi Net*, Nguyen Thi Phuong Thao Food Technology Faculty, Ho Chi Minh City University of Food Industry *Email: netnguyen1120@gmail.com PCR technique is getting more and more popular used in researchses of detection the type of animal tissues by amplifying the desired DNA sequences The first step in the application of the PCR method that we have studied and successfully established the process distinguished between pork and beef by multiplex PCR technique (m-PCR) based on Cytochrome B gene amplification through using specific primer pairs The optimal parameters for the process include: the mating temperature between the primer pairs and the DNA template in the DNA amplification process to distinguish pork and beef by m-PCR is 59ºC, the optimum concentration of each primer is 0,4 μM and the sensitivity of the method is 0.1ng/μl We have applied the m-PCR process to 12 canned beef samples which are labeled without pork The pork’s ingredient of samples involve samples (33.33%); the one that don’t have pork’s ingredient of samples contain samples (66.67%) Therefore, this process has the scientific basis to develop on some processed beef, with a larger sample Keywords: multiplex PCR, detection, beef, pork, Cytochrome - B 276 ... B? ?ớc đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát thịt heo thịt b? ? thực phẩm Mẫu chứng dương bao gồm mẫu động vật thịt b? ? thịt heo Mẫu chứng âm mẫu tôm, mực, cá, gà Mẫu thực tế mẫu đồ hộp thịt b? ?. .. thấy, b? ?ớc đầu thành cơng việc xây dựng quy trình thực nghiệm khuếch đại gen Cytochrome - B nhằm mục đích phát thịt heo diện sản phẩm thực phẩm chế biến từ thịt b? ? 3.4 Kết thử nghiệm quy trình m -PCR. .. OD260/OD280 (b? ??ng 2) 271 B? ?ớc đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát thịt heo thịt b? ? thực phẩm B? ??ng Giá trị OD tỷ số A260/A280 mẫu tách chiết Mẫu OD260 OD260/OD280 CDNA (µg/ml) B? ? 0,55 1,98 27,3 Heo