1. Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu
2.2.8.Phƣơng pháp xác định độ nhạy của qui trình
Chứng dương được cung cấp bởi Viện Nuôi Trồng Thủy Sản 2 Thành Phố Hồ Chí Minh có nồng độ 106Copies/ml tiến hành pha loãng xuống tới mức thấp nhất 101Copies/ml .(được pha loãng bậc 10 liên tiếp đến nồng độ 101
) Tiến hành tách chiết RNA và qua bước RT chuyển thành cDNA và đặt phản ứng PCR từ các nồng độ đã pha loãng để xác định độ nhạy của qui trình.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát các đặc tính của mồi
Các cặp mồi YHVf-YHVr, TSVf-TSVr, GAVf-GAVr được thiết kế cho phép nhân bản một đoạn trình tự dài tương ứng 290bp, 130bp, 496bp. Để kiểm tra đặc tính của mồi chúng tôi sử dụng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 trên trang Web của IDT để kiểm tra nhiệt độ lai, kích thước cũng như sự tạo thành cấu trúc thứ cấp của mồi. Sau khi phân tích chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau:
Bảng 3: Khảo sát đặc tính của mồi
Đặc tính Mồi Kích thước (Bp) Tm %GC YHVf 24 58,60C 45,8% YHVr 25 56,60C 45,8% TSVf 28 57,60C 42,9% TSVr 26 58,40C 44,4% GAVf 27 58,80C 44,4% GAVr 26 58,30C 41,4%
Từ kết quả phân tích ở trên, chúng tôi nhận thấy rằng:
- Về kích thước ,các cặp mồi đều đạt yêu cầu về chiều dài cho phép khả năng nhân bản tốt nhất của mồi (khoảng từ 18-25bp)
- Về nhiệt độ biến tính , sự chênh lệch về nhiệt độ biến tính của mồi xuôi và mồi ngược dao động trong giới hạn cho phép.
- Về thành phần %GC đảm bảo trong khoảng cho phép (40- 60%) là khoảng tỉ lệ tốt nhất cho sự nhân bản của mồi.
Kiểm tra các cấu trúc thứ cấp của các cặp mồi trên phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 . kết quả như sau:
Tất cả các mồi đều cho thấy có sự hình thành cấu trúc kẹp tóc và sự hình thành cấu trúc self-dimer. Tuy nhiên hầu hết các cấu trúc này đều có năng lượng dG>-9kcal/mol( Theo lý thuyết các cấu trúc thứ cấpcó dG >-9Kcal/W sẽ không gây ảnh hưởng đến hoạt động của mồi).
Self dimer của các cặp mồi
Hình 5 : Các dạng cấu trúc self-dimer của các mồi
Chú thích: A: YHVf C: TSVf E: GAVf B: YHVr D: TSVr F: GAVr
Về cấu trúc hetrodimer của các cặp mồi, do chúng tôi sử dụng Multiplex RT- PCR sử dụng cùng lúc 3 cặp mồi trong một phản ứng nên không thể tránh khỏi việc tạo thành cấu trúc thứ cấp giữa các mồi là điều không thể tránh khỏi. Qua khảo sát chúng tôi cũng nhận thấy tất cả các mồi đều có sự hình thành cấu trúc hetero-dimer với nhau. Tuy nhiên tất cả các cấu trúc này đều có năng lượng lớn hơn -9kcal/mol.
C D
A B
YHVf-YHVr YHVf-GAVr
YHVf-TSVf YHVr- TSVf
YHVf-TSVr YHVr- TSVr
YHVf-GAVf TSVf- TSVr
TSVf-GAVf YHVr- GAVr TSVf-GAVr TSVr- GAVf YHVr-GAVf TSVr- GAVr