1. Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu
3.3.3.Khảo sát nhiệt độ lai(Ta) cho 3 cặp mồi
Nhiệt độ lai là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, đặc biệt là đối với Mugltiplex RT-PCR dùng để phát hiện đồng thời 3 virus gây bệnh trên tôm. Nó đòi hỏi một nhiệt độ lai thích hợp để có thể nhân bản được lượng bản copy cDNA tốt nhất để có thể phát hiện bệnh trên tôm. Để khảo sát nhiệt độ lai thích hợp cho qui trình chúng tiến hành:
Đặt 8 mix phản ứng đồng nhất về thành phần chỉ khác nhau là chạy ở những nhiệt độ khác nhau.
Thành phần phản ứng:
12,5µl master mix 0.5µl mỗi cặp mồi
2.5µl mỗi loại chứng (+)( YHV,TSV,GAV) 5 4 3 2 1 M
Bổ sung thêm nước 2 lần cho đủ 25µl
Tiến hành phản ứng ở một gradient nhiệt độ 540C, 550C, 560C, 570C, 580C, 590C, 600C, 610C
Kết quả như sau:
Hình 21: Khảo sát nhiệt độ lai
Chú thích:
M: Thang Giếng 6: Phản ứng ở 590C Giếng 1: Phản ứng ở 540
C Giếng 7: Phản ứng ở 600C Giếng 2: Phản ứng ở 550C Giếng 8: Phản ứng ở 610C Giếng 3: Phản ứng ở 560C Giếng 9: chứng âm
Giếng 4: Phản ứng ở 570C Giếng 5: Phản ứng ở 580C
Tín hiệu ở giếng 590C cho tín hiệu rõ nét nhất cho cả ba cặp mồi. Chứng âm không có tín hiệu chứng tỏ kết quả trên là tin cậy. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn 590C là nhiệt độ lai của qui trình để khảo sát các điều kiện tiếp theo.
3.3.4. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu cho ba cặp mồi
Độ đặc hiệu là sự bắt cặp của ba cặp mồi trong phản ứng Multiplex với đoạn gene của ba loại virus YHV, TSV, GAV mà không bắt cặp với gene của virus khác cũng gây bệnh trên tôm. Tiến hành khảo sát độ đặc hiệu với những chủng virus khác như: White Spot Syndrome Virus(WSSV), Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus(IHHNV), Monodon Baculovirus(MBV), Hepatopancreatic parvovirus (HPV). Tất cả chứng dương của các loại virus đó đều đã được kiểm tra hoạt động tốt. Kết quả như sau:
Hình 22 : Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của 3 cặp mồi
Ghi chú: Giếng 1: Chứng âm
Giếng 2: IHHNV(+) với cặp mồi IHNV(318 bp) Giếng 3: IHHNV với ba cặp mồi TSV-YHV-GAV Giếng 4: WSSV(+) với cặp mồi WSSV (280 bp) Giếng 5: WSSV với ba cặp mồi TSV-YHV-GAV
Giếng 6: MBV(+) với cặp mồi MBV(585 bp) Giếng 7: MBV với ba cặp mồi TSV-YHV-GAV Giếng 8: HPV(+) với cặp mồi HPV(447 bp) Giếng 9: HPV với ba cặp mồi TSV-YHV-GAV Giếng 10: TSV-YHV-GAV (+)
M: Thang 100
Kết quả cho thấy phản ứng Multiplex với 3 cặp mồi thiết kế chỉ bắt cặp với ba loại virus TSV, GAV, YHV mà không bắt cặp với các loại virus khác. Chứng âm
không có tín hiệu chứng tỏ kết quả trên là đáng tin cậy. Như vậy các cặp mồi chúng tôi thiết kế có sự đặc hiệu cao.
3.3.5. Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi
Độ nhạy là một yếu tố quyết định giá trị của phương pháp chuẩn đoán. Độ nhạy cho biết lượng bản sao nhỏ nhất mà một phương pháp có thể cho kết quả dương tính. Để xác định độ nhạy của qui trình, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu chứng dương ban đầu của ba loại virus thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở mỗi nồng độ chúng tôi tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trước. Từ đó chúng tôi sẽ xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả dương tính. Nồng độ chứng dương ban đầu là 106 pha loãng 10 lần thành 105, 104, 103, 102. tiến hành phản ứng Multilplex PCR ở các nồng độ này để xác định độ nhạy của qui trình.
Thành phần phản ứng: 12,5µl master mix
0.5µl mỗi cặp mồi YHV, TSV, GAV
2.5µl mỗi loại chứng (+)( YHV,TSV,GAV) pha loãng ở các nồng độ Bổ sung thêm nước 2 lần cho đủ 25µl
Kết quả như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 23: Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi
Chú thích:
Giếng M: thang 100 Giếng 1: nồng độ 106 Giếng 2: nồng độ 105 Giếng 3: nồng độ 104 Giếng 4: nồng độ 103 Giếng 5: nồng độ 102
Giếng 6: chứng âm
Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy ở nồng độ mẫu là 106 tới 103 vẫn có thể nhìn thấy rõ tín hiệu của các vạch, đến nồng độ 102
không quan sát được rõ vạch nữa. Như vậy chúng tôi có thể kết luận độ nhạy của phản ứng là 103 copies/ml. Với phương pháp dựa trên PCR và điện di để nhận biết thì việc có thể phát hiện mẫu ở nồng độ 103
là tương đối tốt. Việc chứng âm không xuất hiện tín hiệu cho thấy qui trình không bị ngoại nhiễm và kết quả trên là có thể tin cậy được.
3.3.6. Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh.
Với qui trình trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra trên 28 mẫu tôm bệnh nghi
ngờ nhiễm các bệnh do TSV, YHV, GAV gây ra. Kết quả thu được như sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M
Hình 24 : Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh
Ghi chú:
M: thang 100
Mẫu 1-5 được Viện nuôi trồng thủy sản 2 cung cấp Mẫu 5-10 : thu từ Tiền Giang
Mẫu 11-20: thu từ Nha Trang Mẫu 21-27: thu từ Cần Giờ
24 25 26 27 28 ( +) (-) M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M
Bảng 5: Tổng hợp kết quả các mẫu thu đƣợc trong thời gian làm đề tài
Kí hiệu mẫu YHV dƣơng tính TSV dƣơng tính GAV dƣơng tính
1 + - - 2 - + - 3 + - - 4 + - - 5 - - - 6 - - - 7 - - - 8 - - - 9 - - - 10 - - - 11 - - - 12 - - - 13 - - - 14 - + - 15 - - - 16 - - - 17 - - + 18 - - - 19 - - +
20 - - - 21 - + - 22 - - - 23 - - - 24 - - + 25 - - - 26 - - + 27 - - - (+) + + + (-) - - -
Như vậy trong 28 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh có 10 mẫu phát hiện bệnh chiếm tỉ lệ 35% trong tổng số mẫu. Tỉ lệ như vậy chưa đánh giá được đầy đủ hiệu quả của đề tài, nhưng vì không có điều kiện để tìm kiếm mẫu bệnh phẩm, để hoàn thiện được đề tài chúng tôi cần kiểm soát nhiều mẫu hơn nữa.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Trong thời gian làm đề tài chúng tôi đã cơ bản xây dựng thành công qui trình phát hiện đồng thời virus YHV, TSV, GAV trên tôm bằng kỹ thuật Multiplex RT- PCR với độ nhạy 103copies/ml. Qui trình cũng đã được thử nghiệm trên 27 mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh được thu từ Tiền Giang, Cần Giờ- TP Hồ Chí Minh, Nha Trang, và phát hiện được 10 mẫu nhiễm bệnh cho tín hiệu tốt và không có vạch kí sinh.
2. Đề nghị
Với kết quả thu được chúng tôi có những kiến nghị sau:
1. Tiếp tục khảo sát thêm các chỉ tiêu về nồng độ primer tối ưu, nồng độ Mg2+ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
và các chỉ tiêu khác.
2. Làm thực nghiệm trên nhiều mẫu tôm hơn nữa để có được một kết quả chính xác hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2006. Sinh Học Phân Tử
2. Kathy F.-J. Tang a,*, Kirsten M. Spann b, Leigh Owens c,Donald V.
Lightner a, 2001. In situ detection of Australian gill-associated virus with a yellow head virus gene probe.
3. Arun K. Dhar *, Michelle M. Roux, Kurt R. Klimpel, 2002.
Quantitative assay for measuring the Taura syndrome virus and yellow head virus load in shrimp by real-time RT-PCR using SYBR Green chemistry .
4. Jocelyne Mari,1, 2 Bonnie T. Poulos,1 Donald V. Lightner1 and Jean-
Robert Bonami2, 2002. Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization
and similarity with members of the genus Cricket paralysis-like viruses()
5.Priyanjalie K.M. Wijegoonawardanea,1, Jeff A. Cowleya,b,∗, Peter J.
Walkera,A consensus real-time RT-PCR for detection of all genotypic variants of
yellow head virus of penaeid shrimp.
6.P.J. Walkera and N. Sittidilokratna.Yellow Head Virus .
7.Heidi S. Erickson1,*, Martha Zarain-Herzberg2, Donald V.
Lightner1, 2002. Detection of Taura syndrome virus (TSV) strain differences using
selected diagnostic methods: diagnostic implications in penaeid shrimp.
8. L. M. Nunan*, B. T. Poulos, D. V. Lightner, 1998. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) used for the detection of Taura Syndrome Virus (TSV) in experimentally infected shrimp
9.Wansika Kiatpathomchai , Wansadaj Jareonram, Sarawut
Jitrapakdee , T.W. Flegel, 2007. Rapid and sensitive detection of Taura syndrome
virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
10.Wansika Kiatpathomchai,Wansadaj Jaroenram, Narong Arunrut
by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick
11.Priyanjalie K.M. Wijegoonawardane , Jeff A. Cowley , Thuy Phan ,
Richard A.J. Hodgson ,Linda Nielsen , Wansika Kiatpathomchai , Peter J.
Walker ,2008. Genetic diversity in the yellow head nidovirus complex.
12.Wansika Kiatpathomchai a,b, Sarawut Jitrapakdee b,c, Sakol
Panyimc, Vichai Boonsaeng b,∗,2004. RT-PCR detection of yellow head virus
(YHV) infection in Penaeus monodon using dried haemolymph spots. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
13.Nusra Sittidilokratna a,b,∗, Natthida Phetchampai a,b, Vichai
Boonsaeng b, Peter J. Walker c, 2005. Structural and antigenic analysis of the
yellow head virus nucleocapsid protein p20.
14. Priyanjalie K.M. Wijegoonawardanea,1, Jeff A. Cowleya,∗, Peter
J.Walkera,b, 2008. Consensus RT-nested PCR detection of yellow head complex
genotypes in penaeid shrimp.
15.Jeff A. Cowley'.: Christine M. ~immock'C, hainarong
wongteerasupaya2, Vichai ~ o o n s a e n g ~ ,Sakol panyim3, Peter J. walker',
1999. Yellow head virus from Thailand and gill-associated virus from Australia are
closely related but distinct prawn viruses.
16.Jeff A. Cowley a,∗, Lee C. Cadogana, Chainarong Wongteerasupaya
b,Richard A.J. Hodgsona, Vichai Boonsaeng c, Peter J. Walker a, 2003.
Multiplex RT-nested PCR differentiation of gill-associated virus (Australia) from yellow head virus (Thailand) of Penaeus monodon.
17.Gun Anantasomboona,b, Raksawan Poonkhumc, Nusara
Sittidilokratnab,d,Timothy W. Flegelb,e,_, Boonsirm Withyachumnarnkula,b,
2007. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow
18. James Munro , Leigh Owens, 2008. Production of polyclonal and monoclonal antibodies against gill-associated virus and the development of an ELISA