nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện gen độc tố của b. cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật multiplex pcr

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm (VSATTP) vấn đề ưu tiên hàng đầu quốc gia giới VSATTP liên quan trực tiếp tới sức khỏe người VSATTP khơng đảm bảo gây tổn thất không nhỏ cho kinh tế Ước tớnh năm có khoảng 34 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Những năm qua, kinh tế nước ta đổi mới, phát triển nhiều khởi sắc; đời sống nhân dân cải thiện Bên cạnh đú cỏc vụ ngộ độc thức ăn xảy thường xuyên, khắp nơi ngày nhiều mà nguyên nhõn chớnh nhiễm khuẩn Có dạng ngộ độc vi sinh vật: + Do thực phẩm ăn bị nhiễm vi khuẩn: Salmonella, shigella, E coli,Vibrio… + Do thực phẩm ăn bị nhiễm độc tố vi khuẩn: độc tố tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), độc tố vi khuẩn gây ngộ độc thịt (Clostridium botulinum), độc tố vi khuẩn gây nhiễm vào loại ngũ cốc, gia vị, loại thực phẩm khác Bacillus cereus (B.cereus) Ngộ độc nguyên nhân vi khuẩn chiếm khoảng 2/3 vụ ngộ độc thực phẩm Trong số nguyên vi khuẩn, B.cereus biết đến nguyên gây ngộ độc thực phẩm quan trọng nước phát triển phát triển, thu hút quan tõm mặt lõm sàng lẫn chẩn đoán phịng xét nghiệm B.cereus có mặt khắp nơi mơi trường, gõy bệnh cách sinh độc tố Tại châu Âu từ năm 1973-1985 vụ ngộ độc thực phẩm B.cereus chiếm khoảng 17,8% trường hợp ngộ độc thực phẩm [12], Hà Lan 19% Đài Loan xếp thứ nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm [16].Tại Norway từ năm 1988-1993 B.cereus chiếm khoảng 33% tổng số nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, Iceland từ năm 1985-1992 tỷ lệ 47% tỷ lệ thấp quốc gia khác: Mỹ 1,3% Canada 2,2% B.cereus tìm thấy khoảng 25% sản phẩm thực phẩm lấy mẫu: kem, bánh, thịt, khoai tây, sữa, gạo Ô nhiễm sản phẩm thực phẩm thường xảy trước nấu [26] Có nhiều phương pháp xác định B.cereus gây ngộ độc thực phẩm: o Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập đặc tính sinh hóa, sinh lý B.cereus Tuy nhiên phương pháp xác định thực phẩm có hay khơng có B.cereus mà khơng phát thực phẩm có độc tố hay khơng o Phương pháp ELISA sử dụng để phát độc tố thực phẩm, nhiên phương pháp gián tiếp nên độ nhạy không cao [13] o Phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phõn tử phản ứng khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR) sử dụng rộng rãi nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng chẩn đoán tác nhân gây ngộ độc có thực phẩm Phương pháp cho phép xác định xác nhiễm thực phẩm với chủng vi khuẩn gây bệnh thơng qua có mặt đoạn gen đặc hiệu vi khuẩn gây bệnh.Ưu điểm kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, kể nguyên vật liệu Ở Việt Nam có vài nghiên cứu công bố việc sử dụng kỹ thuật PCR để phát nguyên gây ngộ độc thực phẩm vi khuẩn S.aureus, E coli O157, Salmonella… chưa đề cập đến việc xác định gen gây độc B.cereus thực phẩm Trên thưc tế, Việt Nam nước có điều kiện khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B.cereus phát triển thực phẩm giải phóng độc tố, ý thức người dân chưa đầy đủ đặc biệt việc sử dụng nhiều sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm B.cereus không nhỏ Việt Nam việc nghiên cứu áp dụng kỹ thuật với nhiều cặp mồi có độ nhạy , độ đặc hiệu cao nhằm phát gen đặc hiệu B.cereus gây ngộ độc thực phẩm phản ứng để tiết kiệm thời gian kinh phí cần thiết có ý nghĩa thiết thực, giúp nghiên cứu sâu nguyên gây ngộ độc thực phẩm B.cereus Để góp phần kiểm sốt VSATTP, giảm chi phí xã hội thơng qua việc ngăn ngừa vụ ngộ độc thực phẩm B.cereus nâng cao lực kiểm soát VSATTP quan chức Đề tài “Nghiờn cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B cereus thực phẩm kỹ thuật multiplex PCR” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B cereus kỹ thuật Multiplex-PCR quy mơ phịng thí nghiệm Thử nghiệm quy trình để phát gen độc tố B.cereus số thực phẩm có nguồn từ gạo Hà nội CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH VỆ SINH AN TỒN THỰC PHẨM 1.1.1 Trên giới Ngày B.cereus coi nguyên quan trọng gây ngộ độc thực phẩm khơng phổ biến Salmonella lồi khỏc gõy bờnh qua thực phẩm [27] Tuy nhiên số lượng xác trường hợp ngộ độc thức ăn B.cereus không ghi nhận cách đầy đủ Giữa năm 1972 năm 1983 trường hợp ngộ độc thức ăn B.cereus chiếm 2% tổng số dịch bệnh truyền qua thực phẩm Năm 1980: ổ dịch báo cáo với trung tâm kiểm soát dịch bệnh, bao gồm thực phẩm thịt bò, gà tây … Năm 1981: ổ dịch báo cáo chủ yếu liên quan đến gạo, nhiều vụ dịch khác không báo cáo bị chẩn đoán sai vỡ cỏc triệu chứng tương tự nhiễm độc Staphylococcus aureus (B.cereus loại gây nôn) C.perfringens (B.cereus loại tiêu chảy) [24] 1.1.2 Ở Việt Nam Việc đời cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm đánh dấu bước quan trọng công tác quản lý chăm sóc sức khỏe cho nhân dân bao gồm bệnh lây truyền qua đường thực phẩm Ngộ độc thực phẩm vấn đề quan tâm hàng đầu Việt Nam, theo ước tính Y tế, riêng năm 2001 cú 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Ở nước ta theo báo cáo y tế, có khoảng 38 trung tâm y tế có khả kiểm nghiệm loài vi khuẩn này, khoảng 60% tỉnh thành có lực kiểm nghiệm [8] Từ năm 2001-2006, nước ghi nhận 5600000 ca tiêu chảy ngộ độc thực phẩm, có 84 ca tử vong Riêng tháng đầu năm ngoái ghi nhận 750.000 ca tiêu chảy có 12 ca tử vong Thực tế theo chuyên gia phải gấp 10 lần số công bố Đặc biệt năm vừa qua xảy nhiều vụ dịch ngộ độc thực phẩm Salmonella, Staphylococcus aureus, phần lớn xảy bếp ăn tập thể khu cơng nghiệp … Tuy nhiên, chưa có thống kê rõ ràng nguyờn gây vụ ngộ độc thực phẩm Điều phản ánh đầu tư chưa mức nguồn lực công tác tra giám sát VSATTP đặc biệt vào cỏc phũng xét nghiệm thực phẩm hạn chế ảnh hưởng đến công tác bảo đảm VSATTP Mặc dù xảy nhiều vụ ngộ độc thực phẩm mà nguyên B.cereus chưa có cơng bố tình hình ngộ độc thực phẩm B.cereus gây Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu nhằm xác định thực trạng ô nhiễm vi khuẩn thực phẩm Các giám sát tình trạng nhiễm thực phẩm năm vừa qua chủ yếu tập trung vào việc đánh giá thực trạng ô nhiễm thực phẩm với E.coli, staphylococus, vibrio… Việt Nam quốc gia có khí hậu nóng ẩm điều tạo điều kiện thuận lợi cho B.cereus phát triển thực phẩm giải phóng độc tố, ý thức người dân chưa đầy đủ đặc biệt việc sử dụng nhiều sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm B.cereus không nhỏ Việt Nam 1.2 VÀI NẫT VỀ BACILLUS CEREUS 1.2.1 Cỏc nghiên cứu B.cereus Trên giới Các vụ ngộ độc thực phẩm B.cereus gặp nước phát triển phát triển Thức ăn nhiễm độc B.cereus khái niệm phổ biến khắp giới Q trình nấu chín khơng tiêu diệt vi khuẩn B Cereus có khả tạo thành dạng bào tử để tự vệ, ăn sau nấu bào tử khơng có hội phục hồi, điều kiện bảo quản không sau nấu bào tử nảy mầm, tạo thành tế bào sinh dưỡng nhân lên Đặc biệt cơm nhiễm B.cereus khơng có biểu khác thường mùi vị, màu sắc nên nhận biết, nhiều trường hợp ngộ độc cơm nguội lại lại nghĩ đến nguyên nhân ngộ độc loại thức ăn khác B Cereus có khả sản sinh nhanh phát triển nhiều loại thực phẩm khác như: rau sống, giá đỗ, bơ sữa [44] Đõy mối lo ngại vệ sinh, an toàn thực phẩm cho nhiều quốc gia giới Vì việc nghiên cứu dịch tễ, chế bệnh sinh, độc tố B.cereus ngày trọng B.cereus lần Frankland phân lập mô tả năm 1887 Tuy nhiên, tận năm 1950, vi khuẩn Hauge cộng chứng minh nguyên gây vụ dịch ngộ độc thức ăn Các vụ dịch ngộ độc thức ăn B.cereus với đặc điểm nôn tiêu chảy [18] Để khẳng định B.cereus nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge phỏt triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106/ml uống 200ml cocktail Sau 13h, ông cảm thấy đau bụng tiêu nhiều nước, triệu chứng dai dẳng khoảng 8h Hơn 20 năm sau, triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác chủng B cereus gây lại xuất cỏc cụng nhân người Anh Triệu chứng nặng triệu chứng nôn mửa kéo dài thời gian ngắn (chưa đến 5h), điều cho thấy nhiễm độc Việt Nam: Ở nước ta theo báo cáo từ y tế, có khoảng 38 trung tâm y tế có khả kiểm nghiệm lồi vi khuẩn này, khoảng 60% tỉnh thành có lực kiểm nghiệm Tuy nhiên phương pháp xét nghiệm dựa phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với xét nghiệm hóa sinh khác Phương pháp có nhược điểm thời gian lâu, nhiều ngày vài tuần, độ xác khơng cao khơng có khả động Kỹ thuật ELISA sử dụng để phát độc tố thực phẩm, nhiên qui trình tương đồi phức tạp phải có cán kinh nghiệm đào tạo thực được, kỹ thuật chưa áp dụng Việt Nam [13] Tại Việt Nam, có Trần Linh Thước CS ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xét nghiệm số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm như: E.coli, E.coli 0157 :H7, Salmonella spp, Shigella spp, V.cholerae, V.parahaemolyticus, C.perfringens, B.cereus, S.aureus, Listeria monocytocytes Campylobacter spp Trong nghiên cứu này, tác giả chọn gen gyr B để phát B.cereus thực phẩm cho kết phát tương đương với kết phương pháp nuôi cấy [8] Tuy nhiên, kỹ thuật nghiên cứu phát tồn B.cereus thực phẩm mà phát chủng vi khuẩn liệu có mang độc tố hay khơng 1.2.2 Một số hình ảnh Bacillus cereus Bacillus cereus kính hiển vi Khuẩn lạc Bacillus cereus môi trường thạch máu cừu 1.2.3 Đặc tính sinh học B.cereus B.cereus trực khuẩn kỵ khí, gram dương, rộng khoảng μm, dài khoảng 3-4μm, có khả sinh nha bào, bào tử dạng hình ovan sống sót xử lý nhiệt hóa chất [11], chúng có khả thích nghi với loạt điều kiện mơi trường, phân phối rộng rãi tự nhiên bụi, đất, loài động vật khác nhau, thường thấy hạt ngũ cốc, gạo, bột thực phẩm khô lẫn lộn chung với gạo, mì, khoai, ngụ bị nhiễm từ đất trình trồng trọt thu hoạch [32] Đặc điểm ni cấy: • Là loại vi khuẩn dễ mọc trờn mơi trường ni cấy vi khuẩn thơng thường • Tăng trưởng khoảng nhiệt độ 5-500C, tối ưu 35-400C • pH 4,5-9,3, thích hợp pH 7-7,2 • Trên môi trường LB lỏng: đục • Trên môi trường thạch MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin) môi trường thạch Mossel (cereus selective agar) vi khuẩn B cereus mọc tạo thành dạng khuẩn lạc có màu hồng phấn chung quanh có vịng sáng Tính chất sinh hóa: • Trên môi trường đường: lên men glucose điều kiện hiếu khí kị khí, • Khử nitrat thành nitrit • Phân giải Tyroxin • Catalase (+), Citrate (+) Theo phân loại quốc tế B.cereus : • Ngành (phylum) firmicutes • Thuộc giới bacteria • Lớp (class) bacilli • Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceaem • Chi (genius) Bacillus • Loài (species) Cereus Độc tố B.cereus : B.cereus gây bệnh sinh độc tố, B.cereus gây ngộ độc thức ăn sinh loại độc tố bao gồm [18].: 10 • Độc tố ly giải hồng cầu (Hbl), có khoảng 60% số chủng B.cereus xem yếu tố gây độc B.cereus chế hoạt động nội độc tố chưa biết rõ Độc tố gây ly giải hồng cầu có thành phần protein B, L1, L2, protein mã hóa bởi gen nheA, nheB, nheC • Độc tố ruột khơng ly giải hồng cầu (Nhe) độc tố có chất protein thành phần hầu hết chủng B.cereus sinh ra, với thành phần tương tự Hbl ; Độc tố khụng gõy ly giải hồng cầu BL có protein liên kết B mã hóa gen hblA, protein ly giải L1 L2 mã hóa gen hblC hblD Tất hoạt động Hbl cần loại protein • Độc tố T(BceT): độc tố có hoạt động sinh học tương tự Nhe có chất protein thành phần • Độc tố FM (EntFM) độc tố có chất protein thành phần với vai trị đặc tính chưa biết đến • Nội độc tố K (CytK), loại độc tố giống độc tố beta vi khuẩn Clostridium perfring CytK gần đõy phát khoảng 85% số chủng B.cereus • Độc tố gây nơn (Emetictoxin) Độc tố có tên cereulide hình thành trước thực phẩm, nguyên nhõn hội chứng nôn, chất dodecadepsipeptide có vịng acid amin với phân tử lượng 1,2 kDa và/ oxy acid [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] lặp lặp lại lần, bền với nhiệt, pH phân giải protein: hoạt động nhiệt độ 121 0C, có khả chịu điều kiện axit, độc tố gõy nôn phát triển tốt thức ăn từ cơm, khoai tây nghiền, thực phẩm có nhiều tinh bột rau [9 ; 32], X 102 - + - - Chợ Chính Kinh - - - - - Cơm Đường Chùa Bộc - - - - + 38 Cơm Chợ Trung Hòa - + - - - 39 Cơm Chợ Trung Hòa - - - - - 40 Cơm Phố Trung kính Hạ - 35 Cơm Chợ Bưởi 36 Cơm 37 41 Cơm Chợ Mai động + - - - X 10 - - - - - - - - 42 Cơm Chợ Nguyễn Cao X 10 43 Cơm Phạm Ngọc Thạch X 102 - - - - 44 Cơm Thái Hà - - - - - 45 Cơm Chợ Vĩnh Hồ - - + - - 46 Cơm Chùa Bộc 1.8 X 103 - - - - 47 Cơm Đường Kim ngưu - - + + + - - - + 48 Cơm Chợ Mai động X 10 49 Cơm Chợ Nguyễn Cao X 101 + + + + 50 Cơm Chợ Mơ X 103 - - - - 51 Cơm nắm Láng Hạ X 102 + + + + 52 Cơm nắm Chợ Láng Hạ + + + - 53 Cơm nắm Chợ Láng Hạ X 104 + + + - 54 Cơm nắm Chùa Bộc X 101 + - - - 55 Cơm nắm Chùa Bộc - + + + + 56 Cơm nắm Chùa Bộc - + + + + 57 Cơm nắm Chùa Bộc X 105 + - - - 58 Cơm nắm Phạm Ngọc Thạch - - + - - 59 Cơm nắm Phạm Ngọc Thạch X 102 + + + + 60 Cơm Thái Hà X 101 + + + + nắm 61 Cơm nắm Thái Hà X 105 + + + + 62 Cơm nắm Thái Hà X 105 + + + - 63 Cơm nắm Thái Hà 2.9 X 106 + + + + 64 Cơm nắm Thái Hà X 101 + + - - 65 Cơm nắm Chợ Vĩnh Hồ X 105 + + - - 66 Cơm nắm Chùa Bộc X 105 + - - - 67 Cơm nắm Chùa Bộc - - + - - ST T Mã Tên số mẫu Địa điểm thu thập Nuôi cấy Gen độc tố Bcet (622bp ) NheA (499bp) HblD (429bp) HblA (319bp) - - + - - X 102 + - - - X 102 - - - - Kim ngưu X 103 + + - - Chợ Mai động X 103 + - + + Chợ mơ X 104 + - - - Chợ Nguyễn cao X 103 - - - - 5.1 X 103 - + - - X 103 + - - - 6.5 X 104 + + + + - + + - - X 103 + + - - 4.7 X 103 - - - - 5.2 X 103 - - - - - - - - - - - - - - X 104 + + + - 82 Cơm Nắm Cơm Rang Cơm Rang Cơm Rang Bánh dày Bánh dày Bánh dày Bánh dày Bánh dày Bánh dày Bánh dày Bánh dày Bánh dày Bánh dày Bánh dày 83 Xơi vị Chợ Hơm 84 Xụi xéo Chợ Nguyễn cao 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 Trần Xuân Xoạn Chợ Hôm Chợ mơ Chợ Nguyễn cao Chợ Hôm Thái Hà PHỤ LỤC 2: QUI TRÌNH PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ B CEREUS BÀNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR Nguyên lý của qui trình : Phản ứng Multiplex-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế nhằm phát trực tiếp gen độc tố vi khuẩn B.cereus : bceT, nheA, hblA hblD mẫu thực phẩm bị nhiễm với B.cereus có mang gen độc tố I Sinh phẩm hóa chất 1.1 Chủng vi khuẩn - Chủng B cereus chuẩn ATCC4342 sử dụng làm chứng dương - Chủng E coli không mang gen độc tổ làm chứng âm 1.2 Hóa chất - Các dung dịch đệm phosphat (PBS) pH: 7,4 - Môi trường LB lỏng - Thạch LB - Các cặp mồi (Primers) : Tên mồi Trình tự (5’-3’) bceT-F: GTG CAG ATG TTG ATG CCG AT ATG CCA CTG CGT GGA CAT AT hblD-F: hblD-R AAT CAA GAG CTG TCA CGA AT CAC CAA TTG ACC ATG CTA AT Genbank No : GTT TTT ATT GCT TCA TCG GCT hblA-F: hblA-R: 429 TAC GCT AAG GAG GGG CA nheA-R: Độc tố GTT GAT TTT CCG TAG CCT GGG nheA-F: Tài liệu tham khảo CGT ATC GGT CGT TCA CTC GG bceT-R: Gen Kích thước (bp) gây tiêu - Dung dịch tách triết DNA khuôn mẫu : TE (Tris-EDTA) - Dung dịch MgCl2 25mM - Taq DNA polymerase - Hỗn hợp dNTPs 2,5mM U63928 - Nước siêu - Đệm tra mẫu : Gel Loading Buffer - Thạch điện di (electrophoresis agarose) - Dung dịch đệm điện di TAE - Ethidium bromide - Thang chuẩn DNA (DNA ladder) III Dụng cụ máy móc - Mỏy luân nhiệt PCR - Máy điện di ngang - Máy soi gel chụp ảnh tự động - Máy li tâm - Tủ lạnh sâu: -300C - Tủ ấm 370C - Máy đồng mẫu - Lò vi sóng - Lị hấp ướt - Túi đồng mẫu - Pipet định mức, đầu cụn cỏc loại, ống PCR, ống effpendorf loại 1,5 ml, 0,2ml, ống Falcon 15ml, găng tay, giấy thấm IV Thu thập mẫu thực phẩm : Các mẫu thực phẩm thu thập để phát có mặt gen độc tố B cereus phải đảm bảo tiêu chuẩn: + Tối thiểu 100g/mẫu + Đại diện cho cỏc lụ thực phẩm + Được đựng vào cỏc tỳi vô trùng + Các mẫu giữ tủ lạnh nhiệt độ từ 0-5 0C -200C chưa tiến hành xét nghiệm + Sau thu thập, mẫu nên tiến hành xét nghiệm sớm tốt V Tiến hành Bước 1: Chuẩn bị mẫu - Cân 10 gam mẫu thực phẩm + 90ml dung dịch dờm PBS cho vào túi đồng mẫu - Đồng mẫu máy đồng mẫu - Hút 10ml dung dịch mẫu đồng sang ống Falcon 15ml ly tâm 5000vòng/ 10 phút bỏ dich giữ lại cặn - Cho ml mơi trường LB lỏng ủ 370C vịng 4-5 - Ly tâm 5000vòng/ 10 phút bỏ dịch giữ lại cặn - Nhỏ 200àl dung dịch TE trộn máy trộn voltex - Hút dụng dịch sang tube eppendorf 1,5 ml - Cho vào heating block, ủ 950C 10 phút - Ly tâm 13.000 vòng/ 10 phút - Hút dịch sang tube eppendorf 1,5 ml, giữ -200C để làm khuôn mẫu DNA cho phản ứng Multiplex-PCR - Khuôn mẫu DNA chủng chứng dương chứng âm chuẩn bị cách o Cấy chủng vi khuẩn lên đĩa thạch LB ủ 370C qua đêm o Lấy 4-5 khuẩn lạc cho vào tube eppendorf 1,5 ml có chứa 200àl dung dịch TE trộn máy trộn voltex o Hút dịch sang tube eppendorf 1,5 ml, giữ -200C để làm khuôn mẫu DNA chứng dương chứng âm cho phản ứng Multiplex-PCR bước Bước 3: Tiến hành phản ứng PCR - Pha hỗn hợp cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng 10X buffer mẫu (àl) 2.5mM dNTPs 2.4 25mM MgCl2 bceT-F: bceT-R: nheA-F: nheA-R: hblA-F: hblA-R: hblD-F: hblD-R Primers (mồi) 20àM 1 2.5 U Taq polymerase 0.3àl Nước siêu 5.3 DNA Tổng số: 25àl Chu trình nhiệt chạy PCR : 940C : phút 940C : 15giây 550C : 45 giây 30 chu kỳ 720C : 2phút 720C : 10 phút Giữ 40C - Chuẩn bị thạch điện di 1,5% đụng dịch đệm TAE 1X - Điện di sản phẩm PCR thạch 1,5% đệm TAE 1X 100 V 30 phút - Nhộm gen dung dịch Ethidiumbromide phút - Rửa cách ngâm nước cất 15 phút - Chụp ảnh phân tích kết cách so sánh kích thước băng DNA phát mẫu thực phẩm với băng DNA gen độc tố chủng B cereus ATCC4342, chủng E coli chứng âm (khơng có băng) làm song song phản ứng Mutiplex-PCR thang chuẩn DNA (DNA ladder) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ PHẠM NGUYỆT MINH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA BACILLUS CEREUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR Chuyên ngành: Hoá sinh Mã số : 60.72.04 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn: TS Trần Vân Khánh Hà Nội - 2010 Lời cám ơn Để hoàn thành luận văn này, xin trân trọng cám ơn: • Đảng ủy, Ban Giám hiệu, phòng Đào Tạo Sau đại học trường Đại học Y Hà Nội • Đảng ủy, Ban Giám hiệu, phòng Đào Tạo Sau đại học trường Đại học Y Thái Bình Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Võn Khỏnh, Phú trưởng labo trung tâm Gen-Prụtein, cụ dành nhiều thời gian giúp đỡ, dầy cơng rèn luyện cho ngày trưởng thành học tập sống Hơn tất cụ dạy cho tơi phương pháp nghiên cứu khoa học, tài sản q tơi có giúp ích cho tơi chặng đường Tôi xin trân trọng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Nguyễn Thị Hà,Cử nhân L ê Huy Hoàng người dành cho ý kiến vô quý báu để tiến học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cám ơn GS, PGS, TS hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp, thầy cho nhiều ý kiến quý báu đầy kinh nghiệm giỳp tụi hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cám ơn thầy cô Bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Y Hà Nội, tập thể anh chị Labo trung tõm Gen – Protein, cỏc cơ, anh chị phịng đào tạo sau Đại học trường Đại học Y Thái Bình tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, chồng, anh chị em, bạn bè đồng nghiệp người thân động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm luận văn Hà nội, ngày 23 tháng 11 năm 2010 Phạm Nguyệt Minh NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ELISA: Enzym Linked Immuno S : Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (Miễn dịch gắn men) LB : Luria Bertain MYP : Mannitol Egg Yolk Polymixin PBS : Phosphate Buffer Saline (Dung dịch đệm phosphat) PCR : Polymerase Chain Reaction PFGE : Pulsel-Field Gel Electrophoreis (Kỹ thuật điện di xung trường) RAPD: : Random Amplìied Polymorpic DNA (Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiờn đoạn DNA đa hình) RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism (Phõn tích đa hình ngẫu nhiên chiều dài đoạn cắt DNA) TAE : Tris Acetate EDTA TE : Tris EDTA TSP : Trypticase Soy Polymicin VSATTP: Vệ sinh an toàn thực phẩm MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .4 1.1 TÌNH HÌNH VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 VÀI NẫT VỀ BACILLUS CEREUS 1.2.1 Cỏc nghiên cứu B.cereus .5 1.2.2 Một số hình ảnh Bacillus cereus 1.2.3 Đặc tính sinh học B.cereus 1.2.3 Triệu chứng lâm sàng 13 1.2.4 Các phương pháp chẩn đoán : 14 1.2.5 Điều trị .17 1.2.6 Phòng bệnh .17 1.2.7 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu B.cereus 17 CHƯƠNG 23 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 23 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 23 2.2 VẬT LIỆU VÀ DỤNG CỤ 24 2.2.1 Sinh phẩm, hố chất, dụng cụ máy móc dùng kỹ thuật PCR giải trình tự gen 24 2.2.2 Vật liệu dùng cho nuôi cấy xác định vi khuẩn 25 2.3 PHƯƠNG PHÁP .26 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu .26 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu .30 2.4 GIẢI MÃ TRÌNH TỰ GEN 35 2.4.1 Khuếch đại đoạn gen kỹ thuật PCR đơn mồi 35 2.4.2 Tinh sản phẩm PCR 35 2.4.3 PCR giải trình tự .35 2.4.4 Đọc trình tự gen máy đọc trình tự ABI (Applied Biosystem) .36 2.4.5 So sánh đoạn gen so sánh với trình tự chuẩn ngân hàng gen .36 CHƯƠNG 37 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 XÂY DỰNG QUI TRÌNH MULTIPLEX PCR 37 3.1.1 Xây dựng qui trình chủng B cereus chuẩn ATCC4342 37 3.1.2 Thử nghiệm qui trình thực phẩm gây nhiễm thực nghiệm .38 3.2 KẾT QỦA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR ĐỂ PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP GEN ĐỘC TỐ B CEREUS TRÊN MỘT SỐ THỰC PHẨM TẠI HÀ NỘI 40 40 3.3 KẾT QUẢ GIẢI MÃ TRÌNH TỰ GEN 45 CHƯƠNG 50 BÀN LUẬN 50 4.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA B.CEREUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR VỚI QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM 51 4.2 ỨNG DỤNG QUY TRINHG PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA B.CEREUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR TRÊN MỘT SỐ THỰC PHẨM 52 4.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX -PCR 55 4.3.1 Xác định độ nhạy phương pháp Multiplex-PCR 55 4.3.2 Xác định độ đặc hiệu phương pháp Multiplex-PCR 55 4.4 GIẢI TRÌNH TỰ GEN 56 KẾT LUẬN .57 KIẾN NGHỊ 59 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: So sánh độc tố gây tiêu chảy độc tố gây nôn[33] .12 Bảng 1.2: Các loại độc tố B.cereus 12 Bảng 2.1 Các cặp mồi (primer) đặc hiệu sử dụng cho nghiên cứu để phát gen độc tố B.cereus .24 Bảng 3.1 Kết kiểm tra mẫu thực phẩm trước gây nhiễm thực nghiệm.38 Bảng 3.2: Kết Multiplex-PCR phát trực tiếp gen độc tố B cereus từ thực phẩm 43 Bảng 3.3: Kết phân tích mẫu thực phẩm phương pháp nuôi cấy phương pháp Multiplex-PCR .44 Bảng 3.4: Kết so sánh tỷ lệ phát nuôi cấy PCR 44 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 : Các bước phản ứng PCR 16 (Nguồn : Vierstraete, 1999) 16 Hình 3.1: Kết phát gen độc tố B cereus từ chủng chuẩn ATCC4342 kỹ thuật Multiplex PCR 37 Hình 3.2 Kết phát gen độc tố B cereus thực phẩm gây nhiễm thực nghiệm với chủng B cereus ATCC4342 kỹ thuật Multiplex PCR .39 Hình 3.3 Kết đại diện ứng dụng kỹ thuật multiplex-PCR phát trực tiếp gen độc tố B cereus từ thực phẩm .40 Hình 3.4 Kết đại diện ứng dụng kỹ thuật multiplex-PCR phát trực tiếp gen độc tố B cereus từ thực phẩm .40 Hình 3.5: Kết đại diện phát trực tiếp gen độc tố bceT B.cereus kỹ thuật PCR đơn mồi .41 Hình 3.6: Kết đại diện phát trực tiếp gen độc tố nheA B.cereus kỹ thuật PCR đơn mồi .42 Hình 3.7: Kết đại diện phát trực tiếp gen độc tố hblA B.cereus kỹ thuật PCR đơn mồi .42 Hình 3.8: Kết đại diện phát trực tiếp gen độc tố hblD B.cereus kỹ thuật PCR đơn mồi .43 Hình 3.9 Hình minh họa phần kết giải mã trình tự gen bceT 46 Hình 3.10 Hình minh họa phần kết giải mã trình tự gen nheA 47 Hình 3.11 : Hình minh họa phần kết giải mã trình tự gen hblA 48 Hình 3.12 Hình minh họa phần kết giải mã trình tự gen hblD 49 ... “Nghiờn cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B cereus thực phẩm kỹ thuật multiplex PCR? ?? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B cereus kỹ thuật Multiplex- PCR quy mơ... việc xây dựng qui trình phát trực tiếp gen độc tố B .cereus thực phẩm chưa làm cách hoàn thiện 4.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA B .CEREUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEXPCR... cấy kỹ thuật PCR: 10 mẫu thực phẩm cho kết âm tính, mẫu thực phẩm khơng có độc tố gây ngộ độc thực phẩm B .cereus Các mẫu thực phẩm sử dụng để xác định khả phát gen độc tố kỹ thuật Multiplex- PCR