2.3.2.2. Xác định ô nhiễm B. cereus từ các mẫu thực phẩm bằng phương pháp nuôi cấy [Theo thường qui chuẩn của viện Dinh dưỡng Quốc gia]
Bước 1 : Đồng nhất mẫu
- Cân 10 gam mẫu thực phẩm + 90ml dung dịch đệm PBS cho vào túi đồng nhất mẫu
- Đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất mẫu ta được dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng mẫu đồng nhất thêm 2 đậm độ pha loãng là 10-2 và 10-3 bằng cách:
o Lấy 100àl mẫu ở độ pha loãng 10-1 sang tube effendorf 1.5 ml có chứa 900àl dung dịch đệm PBS vô trùng trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng mẫu 10-2
o Lấy 100àl mẫu ở độ pha loãng 10-2 sang tube effendorf 1.5 ml có chứa 900àl dung dịch đệm PBS vô trùng trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng mẫu 10-3
Bước 2 : Láng mẫu thử nghiệm lờn cỏc đĩa thạch
- Hút 0,1ml dung dịch đồng nhất mẫu của các độ pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 láng lờn cỏc đĩa thạch MYP mỗi đậm độ láng 2 đĩa theo sơ đồ tại hình 2.1.
- Ủ các đĩa thạch MPY ở 37OC/2
- Ủ các đĩa thạch MPY ở 37OC/24-48 giờ.
Bước 3 : Phân tích và đọc kết quả
- Khuẩn lạc B. cereus mọc trờn cỏc đĩa thạch MYP có màu hồng phấn - Đếm số lượng khuẩn lạc có màu hồng phấn mọc trên đĩa MYP và tính số lượng vi khuẩn B. cereus trong 1 gam thực phẩm theo công thức :
N= Số lượng khuẩn lạc của nồng độ pha loãng y X nồng độ pha loãng 10y X101
Ví dụ :
o Ở nồng độ pha loãng 10-3 ta đếm được 150 khuẩn lạc o Thì số lượng vk/ml thực phẩm ban đầu sẽ là :
- N = 150 X 103 X 101 = 1,5X106vk/1gam (hay 1ml thực phẩm) - Lấy khuẩn lạc nghi ngờ mọc trên đĩa cấy lên môi trường thạch nghiêng để thử các tính chất sinh hóa
Bước 4: Xác định hình thể và tính chất bắt mầu
− Lấy khuẩn lạc thuần chủng trên môi trường thạch nghiêng nhuộm Gram: trực khuẩn Gr (+), xếp chuỗi, nha bào hình elip nằm giữa thân vi khuẩn.
− Tạo hỗn dịch vi khuẩn thuần nhất bằng cách lấy vi khuẩn trên môi trường thạch nghiêng dinh dưỡng sang ống nước phosphat, để thử các tính chất sinh vật hóa học.
Bước 5: Xác định tính chất sinh vật hóa học a) Khả năng lên men đường Glucoza
Cấy vi khuẩn vào môi trường Glucoza có chỉ thị mầu đỏ phenol, ủ ấm 35OC/24 giờ. Quan sát sự đổi màu ống thử từ đỏ sang vàng.
b) Khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit
Cấy vi khuẩn từ thạch nghiêng dinh dưỡng vào ống nitrat, ủ 35OC/24 giờ, nhỏ 0,25ml thuốc thử A và B. Quan sát mầu: mầu cam (+)/10 phút.
c) Thử nghiệm VP
− Cấy vi khuẩn vào môi trường clark-lubs, ủ ấm 35OC/48 giờ ± 2 giờ. Nhỏ 0,6ml α-naphton và 0,2ml KOH 40%. Đọc kết quả sau 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
− Nếu xuất hiện màu hồng hoặc màu tím thì kết luận VP (+). d) Thạch Tyrosin
Cấy 1 vòng que cấy vi khuẩn lên toàn bộ mặt nghiêng Tyrosin. ủ ở 35OC/48 giờ. Vi khuẩn phân hủy tyrosin tạo khoảng trong xung quanh khuẩn lạc.
− Cấy vi khuẩn vào ống canh thang dinh dưỡng có 0,001% lyozym. Thử nghiệm có chứng dương và chứng âm.
− Ủ 35OC/24 giờ. Đọc kết quả ống chứng dương và chứng âm trước.
− Nếu âm tính để thêm 24 giờ. f) Thử nghiệm di động
Cấy vào môi trường thạch manit di động ủ ở 30OC/18 – 24 giờ. g) Khả năng tan máu dạng β
Cấy vi khuẩn lên môi trường máu thỏ. ủ ấm 35OC/24 giờ.
Tính chất sinh hoá của B. Cereus: Trực khuẩn Gr (+), có nha bào a) Khả năng lên men đường Glucoza: (+)
b) Manit: (+),
c) Khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit: (+) d) Thử nghiệm VP: (+)
e) Thạch Tyrosin: (+)
f) Thử nghiệm lysozyme: (+) g) Thử nghiệm di động: (+) h) Khả năng tan máu β: (+) i) Lecithinaza: (+)
2.3.2.3. Phát hiện trực tiếp gen độc tố B. cereus từ các mẫu thực phẩm bằng kỹ thuật Multiplex-PCR
Bước 1 : Tách chiết DNA
- Lấy 10ml thực phẩm đã được đồng nhất ly tâm 15000vũng/phỳt X 10 phút, bỏ dich nổi giữ lại cặn
- Hoà tan cặn vào 5 ml dung dịch LB lỏng ủ 370C 4-5 giờ - Ly tâm 15000vũng/phỳt X 10 phút bỏ dich nổi giữ lại cặn
- Nhỏ 200àl dung dịch TE trộn đều bằng máy trộn voltex - Cho vào heating block, ủ ở 950C X 10 phút
- Hút dịch nổi sang một tube eppendorf 1,5 ml, giữ ở -200C để làm khuôn mẫu cho phản ứng Multiplex-PCR
Bước 2 : Tiến hành phản ứng PCR (bước 3, phần 2.3.1.1)
2.3.2.4. Xác đinh lại gen độc tố B. cereus từ các mẫu thực phẩm bằng kỹ thuật PCR đơn mồi
Bước 1: Pha hỗn hợp cho phản ứng PCR
Thành phần phản ứng 1 mẫu (àl) 10X buffer 3 2.5mM dNTPs 2.4 25mM MgCl2 3 Cặp primers * bceT-F 1 bceT-R 1 2.5 U Taq polymerase 0.3 Nước siêu sạch 11.3 DNA 3 Tổng số: 25àl
Ghi chú : Tùy từng mẫu cụ thể mẫu nào có gen dương tính ở phản ứng multiplex-PCR thì sẽ sử dụng cặp mồi của gen đó để làm phản ưng PCR đơn mồi để xác định lại.
- Bước 2: Chu trình nhiệt chạy PCR 1 940C : 5 phút
940C : 15giây
2 550C : 45 giây 30 chu kỳ 720C : 2 phút
3 4
720C : 10 phút Giữ ở 40C
- Bước 3 : Điện di
- Bước 4 : Chụp ảnh và phân tích kết quả