B.CEREUS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX- PCR TRÊN MỘT SỐ THỰC PHẨM
Từ những thành công khi phát hiện gen độc tố của B.cereus từ thực phẩm bằng phương pháp Multiplex-PCR trong phòng thí nghiệm chúng tôi đã ứng dụng qui trình trên thực hiện ở một số thực phẩm có nguồn gốc từ gạo thu thập tại chợ Hà Nội. Kết quả điện di sản phẩm DNA tách chiết từ thực phẩm thấy các vạch gọn, bờ đều, phân tách rõ ràng (hình 3.3, hình 3.4). Kết quả PCR dương tính được tính khi mẫu kiểm nghiệm dương tính với 1 gen trở lên. Trong nghiên cứu này, chỳng tôi thực hiện song song qui trình phát hiện gen độc tố của B.cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật Multiplex-PCR sau khi đã hoàn thiện với phương pháp nuôi cấy truyền thống phát hiện B.cereus
trờn các mẫu thực phẩm này.
Phương pháp nuôi cấy truyền thống phát hiện B.cereus trong thực phẩm gồm các bước theo qui trình chuẩn của viện Dinh dưỡng Quốc gia
Kết quả của hai phương pháp cho thấy phương pháp truyền thống chỉ phát hiện được 62% tổng số thực phẩm nghiên cứu, phương pháp Multiplex- PCR phát hiện được 72,6% (Bảng 3.4). Như vậy so với phương pháp nuôi cấy truyền thống, qui trình phát hiện gen độc tố của B.cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật Multiplex-PCR đã được hoàn thiện có nhiều ưu điểm :
- Đơn giản hơn rất nhiều, không đòi hỏi có những cán bộ kinh nghiệm và được đào tạo bài bản mới có thể thực hiện được,
- Tốn ít thời gian hơn. Toàn bộ qui trình mất khoảng 8-10 giờ.
- Xác định chính xác thực phẩm có bị nhiễm độc tố không, hiệu quả hơn phương nuôi cấy, phương pháp nuôi cấy chỉ xác định được thực phẩm đú có vi khuẩn B.cereus hay không mà không xác định được thực phẩm đó có khả năng gây ngộ độc không.
Ở trong nước, trong nghiên cứu của mình, Trần Linh Thước và cộng sự [8] chọn gen gyr B để phát hiện B.cereus trong thực phẩm cho kết quả phát hiện tương đương với kết quả bằng phương pháp nuôi cấy cho nên phương pháp này cũng không xác định được thực phẩm có bị nhiễm độc tố có thể gây ngộ độc thực phẩm hay không.
Trong một số công trình nghiên cứu trên thế giới, để phát hiện độc tố của B.cereus gây ngộ độc thực phẩm các tác giả đã đưa ra nhiều phương pháp khác nhau:
+ Gitahi và cộng sự [22] đã sử dụng phương pháp Multiplex-PCR để phát hiện độc tố của B.cereus trong thực phẩm nhưng sau khi vi khuẩn này được nuôi cấy nên phương pháp này tốn nhiều thời gian hơn so với phương pháp của chúng tôi.
+ Jackson N. Ombui và cộng sự [44] cũng sử dụng phương pháp Multiplex-PCR để phát hiện độc tố của B.cereus trong thực phẩm. Trong qui trình này thực phẩm được tạo thành thể đồng nhất sau đó được ủ ở 350C trong
4 giờ, ly tâm ở 15000 vòng trong 5 phút rồi được rửa 4 lần. Qui trình này tương đương với qui trình của chúng tôi.
Ở nước ta, trên thực tế cho đến nay có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp Multiplex PCR để chẩn đoán gen độc tố của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riờng gõy ngộ độc thực phẩm trực tiếp từ thực phẩm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng hoàn thiện một qui trình phát hiện gen độc tố của B. cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR với thời gian thực hiện khoảng 8-10 giờ và không đòi hỏi hoá chất cũng như trang thiết bị phức tạp.
Do giới hạn về khuôn khổ của luận văn, chúng tôi mới tiến hành nghiên cứu ứng dụng qui trình phát hiện gen độc tố của B.cereus trong một số thực phẩm có nguồn gốc từ gạo bằng kỹ thuật multiplex PCR. Vì gạo là lương thực chớnh của con người, nó cung cấp nguồn năng lượng lớn nhất cho người dõn. Ở Việt Nam, dõn số trên 80 triệu và 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạo làm lương thực chớnh, từ gạo có thể chế biến thành mún ăn khác nhau như : bánh đa nem, bỳn, phở.... do đó gạo có vai trò rất lớn trong đời sống của người dõn. Vi khuẩn B.cereus có sẵn trong gạo do bị nhiễm từ đất trong quá trình trồng trọt và thu hoạch lúa. Quá trình chế biến gạo thành cỏc món thức ăn khác không tiêu diệt được vi khuẩn này vỡ nó đó hình thành dạng bào tử để tự vệ, nếu các thức ăn này được ăn ngay sau khi chế biến thì bào tử
B.cereus không có cơ hội phục hồi, nhưng nếu để thức ăn nguội dần ở điều kiện bình thường thì B.cereus có thể hoạt động trở lại và sản sinh ra một số độc tố.
Với tình trạng ô nhiễm nặng của B. Cereus trong các mẫu thực phẩm được phát hiện trong nghiên cứu (Bảng 3.3) cho thấy vai trò quan trọng của
thực phẩm cho nhiều quốc gia trên thế giới vì nó có thể gây ra các vụ ngộ độc tập thể.