2.3.1.1. Phát hiện gen độc tố B. cereus từ chủng ATCC4342
Bước 1 : Định lượng nồng độ vi khuẩn B. cereus/ml huyền dịch
- Cấy chủng chuẩn ATCC4342 lên đĩa thạch LB. Ủ ở 370C/ 24 giờ
- Lấy một khuẩn lạc đĩa thạch LB cấy sang môi trường LB lỏng. Lắc ở 370C trong vòng 6-8 giờ (OD=0,6-0,7)
- Pha loãng bậc 10 huyền dịch vi khuẩn để tạo ra các nồng độ pha loãng vi khuẩn là : 10-1 ; 10-2 ; 10-3 ; 10-4 ; 10-5 ; 10-6 và 10-7…
o Lấy 100àl huyền dịch vi khuẩn cho vào tube eppendorf 1,5 ml có chứa 900àl dung dịch đệm PBS vô trùng trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-1.
o Lấy 100àl ở độ pha loãng vi khuẩn là 10-1 sang chứa 900àl dung dịch đệm PBS vô trùng trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-2.
o Lấy 100àl ở độ pha loãng vi khuẩn là 10-2 sang chứa 900àl dung dịch đệm PBS vô trùng trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng vi khuẩn là 10-3.
o Tiếp tục pha loãng như vậy ta sẽ có được nồng độ pha loãng vi khuẩn từ huyền dịch ban đầu là 10-4 ; 10-5 ; 10-6 và 10-7.
- Láng đều 100àl của 3 nồng độ pha loãng 10-5 ; 10-6 và 10-7 vào 3 đĩa thạch LB. Ủ ở 370C/ 24 giờ.
- Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch LB và tính số lượng vi khuẩn/ml huyền dịch.
- Công thức tính nồng độ vi khuẩn/ml huyền dịch :
N= Số lượng khuẩn lạc của nồng độ pha loãng y X nồng độ pha loãng 10y X101
Ví dụ :
o Ở nồng độ pha loãng 10-5 ta đếm được 20 khuẩn lạc o Thì số lượng vk/ml huyền dịch ban đầu sẽ là :
- N = 20 X 105 X 101 = 2.107vk/1ml
Bước 2 : Tách chiết DNA từ lượng vi khuẩn đã biết trước
- Lấy 1ml huyền dịch vi khuẩn chưa pha loãng ở bước 1cho vào tube eppendorf 1,5 ml
- Ly tâm 10.000 vòng/ 5 phút
- Hút bỏ dịch nổi, giữ lấy cặn vi khuẩn
- Nhỏ 200àl dung dịch TE trộn đều bằng máy trộn voltex
- Cho tube huyền dịch vi khuẩn trong TE vào máy ủ nhiệt ở 950C trong 10 phút.
- Ly tâm 13.000 vòng/10 phút
- Hút dịch nổi sang một tube eppendorf 1,5 ml, giữ ở -200C để làm khuôn mẫu cho phản ứng Multiplex-PCR (bước 3, phần 2.3.1.1)
Bước 3 : Tiến hành làm phản ứng Multiplex-PCR - Bước 1 : Pha loãng khuôn mẫu DNA bậc 10
o Lấy 10àl DNA cho vào tube eppendorf 1,5 ml có chứa 90àl nước siêu sạch trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng DNA 10-1
o Lấy 10àl ở độ pha loãng DNA 10-1 sang chứa 90àl nước siêu sạch trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng DNA 10-2
o Lấy 10àl ở độ pha loãng DNA 10-2 sang chứa 90àl nước siêu sạch trộn đều bằng máy trộn voltex ta được độ pha loãng DNA 10-3
o Tiếp tục pha loãng như vậy ta sẽ có được nồng độ pha loãng DNA từ 200àl DNA tách chiết ban đầu là 10-4 ; 10-5 ; 10-6 và 10-7
- Bước 2 : Pha hỗn hợp cho phản ứng PCR
Thành phần phản ứng 1 mẫu (àl) 10X buffer 3 2.5mM dNTPs 2.4 25mM MgCl2 3 Primers (mồi) 20àM bceT-F: 1 bceT-R: 1 nheA-F: 1 nheA-R: 1 hblA-F: 1 hblA-R: 1 hblD-F: 1 hblD-R 1 2.5 U Taq polymerase 0.3àl Nước siêu sạch 5.3 DNA 3 Tổng số: 25àl
- Bước 3 : Chu trình nhiệt chạy PCR 1 940C : 5 phút 940C : 15giây 2 550C : 45 giây 30 chu kỳ 720C : 2 phút 3 4 720C : 10 phút Giữ ở 40C
- Bước 4: Điện di
o Sản phẩm PCR trên thạch 1,5% trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút
- Bước 5 : Chụp ảnh và phân tích kết quả
o Nhộm gel bằng dung dịch Ethidiumbromide trong 5 phút o Rửa gel trong 5 phút
o Chụp gel trờn mỏy chụp gel, dựa vào thang DNA chuẩn để phân tích kết quả
2.3.1.2. Phát hiện gen độc tố B. cereus trên thực phẩm gây nhiễm thực nghiệm
Bước 1 : Chuẩn bị thực phẩm sạch
Các mẫu thực phẩm được kiểm tra không bị nhiễm B. cereus trước khi gây nhiễm thực nghiệm bằng kỹ thuật nuôi cấy : theo thường qui chuẩn thức của viện dinh dưỡng quốc gia (phần 2.3.2.2 của phần phương pháp) cho kờt quả âm tính
Bước 2 : Chuẩn bị B. cereus ATCC4342
Nuôi cấy và xác định nồng độ vi khuẩn B. cereus gây nhiễm được tiến hành như bước 1 của phần 2.3.1.1.
Bước 3 : Gây nhiễm thực phẩm
Lấy 1ml thực phẩm sạch ở thể đồng nhất trộn với 100 àl huyền dịch vi khuẩn đã biết truớc nồng độ.
Bước 4 : Tách chiết DNA (tương tự bước 2 phần 2.3.1.1)
Bước 5 : Tiến hành làm phản ứng Multiplex-PCR (tương tự như bước 3 của phần 2.3.1.1)