1 2 3 4
A Salmonella Brucella Escherichia coli O157:H7 Clostridium botulinum B Bacillus cereus Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Shighella C Vibrio cholerae Listeria monocytogenes Staphylocoscus aureus Yersinia enterocolitica
Chúng tôi ghi nh n đ c m t s k t qu sau:
u tiên, chúng tôi s d ng s n ph m PCR c a ch ng Staphylococcus aureus v i c p m i 16S đ th nghi m quy trình lai RDB. B c đ u chúng tôi th nghi m nhi t đ lai 45oC và r a lai trong th i gi n γ0 giơy ch ng t i đƣ thu đ c k t qu khá t t, tín hi u phát sáng tr n mƠng l i đ ng v ngay v trí có g n m u dò c a ch ng Staphylococcus aureus (v trí C3) vƠ kh ng c hi n t ng l i chéo. K t qu
nƠy đ c trình bày hình III.22.
Hình III.22. K t qu ph n ng lai RDB trên ch ng chu n Staphylococcus aureus.
M u dò đ c hi u v i DNA c a ch ng Staphylococcus aureus
Nguy n Tr ng Nghĩa 63
S u đ ch ng t i ti p t c ti n hành lai trên các s n ph m PCR c a các ch ng
vi khu n còn l i. K t qu l i nƠy đ c th hi n hình III.23. – Hình III.24.
Hình III.23. K t qu lai RDB trên ch ng chu n Yersinia enterocolitica.
Hình III.24. K t qu lai RDB trên ch ng chu n Salmonella spp. và Shigella spp.
Riêng v i ch ng E. coli ch ng t i ch th c hi n thành công quy trình RDB vì m u dò chúng tôi ti n hành thi t k ch chuyên bi t v i ch ng E. coli O157:H7, tuy nhiên trong nghiên c u này chúng tôi v n ch thu nh n đ c ch ng E. coli O157:H7.
Do đi u ki n khách qu n đ n th i đi m này chúng tôi v n ch hoƠn thi n n i
dung th c nghi m trên các ch ng vi khu n còn l i. Tuy nhi n ch ng t i đƣ t p trung ti n hành th c nghi m trên các m u b nh ph m thu đ c thành ph H Chí Minh. M u dò đ c hi u v i DNA c a ch ng Yersinia entrocolitica M u dò đ chi u v i DNA c a ch ng Shigella spp. M u dò đ c hi u v i DNA c a ch ng Salmonella spp
Nguy n Tr ng Nghĩa 64
III.2.6. K t qu th c nghi tr n u b nh ph
V i các m u b nh ph m thu đ c d ng chai c y máu d ng t nh ch ng t i
ti n hành tách chi t đo OD vƠ th c hi n PCR v i c p m i 16S_F – 16S_R, 23S_F –
23S_R theo quy tr nh đƣ đ c trình bày ph n v t li u vƠ ph ng pháp nghi n c u. Các m u b nh ph m có k t qu PCR d ng t nh ch ng t i s d ng s n ph m PCR
ti n hƠnh ph ng pháp l i RDB theo quy tr nh đƣ đ c t i u m c III.2.4, nh ng
m u b nh ph m có k t qu PCR âm tính chúng tôi không ti p t c th c hi n ph n ng RDB và chúng tôi đƣ thu nh n đ c m t s k t qu nh s u:
Ch ng t i xác đ nh đ c 6 m u b nh ph m có k t qu b t c p d ng t nh v i
m i 16S rDNA khi ch y ph n ng PCR (hình III.25). V i 6 s n ph m PCR này chúng tôi ti p t c th c hi n ph n ng RDB và k t qu xu t hi n vòng phát sáng t i v trí g n m u dò c a ch ng Staphylococcus aureus (hình III.26). Vì v y chúng tôi kh ng đnh 6 m u này có nhi m ch ng Staphylococcus aureus. K t qu nƠy c ng
trùng kh p v i k t qu ch n đoán lơm sƠng đ c cung c p t b nh vi n.
Hai m u b nh ph m có k t qu PCR d ng t nh v i c p m i 23S rDNA (hình III.27), chúng tôi s d ng 2 s n ph m PCR này th c hi n ph n ng RDB, cho k t qu âm tính v i v trí g n m u d đ c hi u c a ch ng E. coli O157:H7 c ng nh các
v trí g n m u dò còn l i. Khi so sánh v i k t qu vi sinh lâm sàng, chúng tôi ghi nh n đ c 2 m u b nh ph m này (m u 6 và m u 12) b nhi m ch ng E. coli nh ng
không ph i là E. coli O157:H7. i u này cho th y đ c đ đ c hi u c a m u dò mà
ch ng t i đƣ ch n l c ch chuyên bi t v i ch ng E. coli O157:H7 nên không b t c p
đ c v i các ch ng vi khu n còn l i.
B y m u b nh ph m còn l i có k t qu âm tính v i ph n ng PCR nên chúng tôi không ti p t c quy trình lai RDB. Khi so sánh v i k t qu , các ch ng vi khu n
đ c ch n đoán lơm sƠng các m u b nh ph m này thì chúng không thu c trong danh m c 6 vi khu n trong nghiên c u này. Tuy nhiên, trong nghiên c u này chúng
t i đƣ thu th p và ch n l c đ c c p m i 16S rDNA ph quát cho h u h t các vi
khu n, nên ch ng t i đƣ ti n hành ki m tr đ đ c hi u c a c p m i này v i trình t 16S rDNA c a 4 ch ng vi khu n b nhi m trong 7 m u b nh ph m và chúng tôi thu k t qu là c p m i 16S rDNA ph quát v i t t c các ch ng vi khu n này (k t qu
Nguy n Tr ng Nghĩa 65
nƠy đ c th hi n ph l c 5). S u đ ch ng t i th c hi n l i ph n ng PCR v i
nh ng m u b nh ph m âm tính này v i l ng DNA b n m u đ c pha loãng 5 l n t DNA g c (thí nghi m l p l i 3 l n), tuy nhiên v n cho k t qu âm tính.
Do v y ch ng t i c h ng gi i quy t trong nh ng n i dung nghiên c u ti p
theo (n u c đi u ki n): c n ph i xác đnh l i thông tin tác nhân vi khu n gây b nh hi n di n trong m u b nh ph m (chai c y m u, ho c các m u b nh ph m khác…)
d vƠo k thu t phân tích vi sinh truy n th ng (nuôi c y, nhu m Gr m đnh danh
s b ). D ki n k t qu c a ph n thí nghi m này:
(1) N u k t qu xác đnh không có s hi n di n c a vi khu n gây b nh nói chung và nhóm vi khu n gây b nh đ ng ru t trong các m u b nh ph m nêu trên (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Stenotrophomonas maltophilia ) cho th y r ng m u b nh ph m không có hi n di n ho c có r t ít s l ng t bào vi khu n, th p h n ng ng phát hi n c a ph n ng PCR v i c p m i 16S rDNA.
(2) N u k t qu xác đ nh có s hi n di n c a nhóm vi khu n gây b nh nêu
tr n ch ng t i đ t ra gi thi t: trong thành ph n chai c y máu có ch a các thành
ph n c ch ho c nh h ng đ n ph n ng PCR trên các DNA c a vi khu n gây
b nh. ơy lƠ đi m l u ý đ ch ng t i đi u ch nh ph ng pháp tách chi t DNA đi u
ch nh l ng DNA b gen vi khu n sau tách chi t c a các m u b nh ph m khác nhau (m u phân, m u n c ti u, chai c y máu …) nh m phù h p v i m c tiêu nghiên c u; ho c đi u ch nh thông s nhi t đ lai c a ph n ng PCR và ph n ng RDB.
Nguy n Tr ng Nghĩa 66
Chú thích: Gi ng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 l n t là s n ph m PCR c a m u b nh ph m t – ng c u n 0 bp. (+ ) ch ng d ng -) ch ng âm.
Hình III.25. K t qu đi n di s n ph m PCR các m u b nh ph đ i di n v i c p m i 16S_F ậ 16S_R.
Hình III.26. K t qu ph n ng lai RDB trên m u b nh ph m s 3
M u dò đ c hi u v i DNA c a ch ng Staphylococcus aureus
Nguy n Tr ng Nghĩa 67
Chú thích: Gi ng 1, 2 l n t là s n ph m PCR c a m u b nh ph m 6, 12 ng c u n bp c ng d ng -) ch ng âm.
Hình III.27. K t qu đi n di s n ph m PCR các m u b nh ph đ i di n v i c p m i 23S_F ậ 23S_R.
ki m ch ng quy trình lai RDB và k t qu ch n đoán lơm sƠng ch ng t i
c ng đƣ g i gi i trình t t i Công ty Nam Khoa 1 m u b nh ph m có nhi m
Staphycoccus aureus v i c p m i 16S_F – 16S_R. K t qu gi i t đ c đem đi
BLAST cho k t qu hoàn toàn kh p v i k t qu lâm sàng và k t qu lai RDB. K t
qu nƠy đ c trình bày ph l c 3, 4.
III.2.7. Kh o sát đ nh y c a ph ng pháp PCR-RDB
Chúng tôi ti n hƠnh xác đ nh m t đ t i thi u t ng s vi khu n hi n di n trong 1 ml d ch vi khu n trong c y máu trong kho ng t 107 – 109 CFU/ml (ph l c
β) đ ng th i ch ng t i xác đ nh n ng đ DNA vi khu n tách chi t t ng ng v i
1 ml d ch vi khu n trong chai c y máu: 34,8175 – 170,2461 µg/ml. Chúng tôi ti n hành th c hi n ph n ng PCR v i c p m i 16S_F – 16S_R v i t ng l ng DNA ban đ u 57 ng có trong 25 µl th tích ph n ng PCR (t ng s chu k khu ch đ i là
40) s u đ ti n hành ph n ng RDB v i l ng s n ph m PCR l n l t là 8 µl,
12 µl, 15 µl, 18 µl. Tuy nhiên, k t qu RDB cho k t qu d ng t nh v i l ng s n ph m khu ch đ i là 12 µl tr lên. Do v y ch ng t i thu đ c d li u v ng ng lai
Nguy n Tr ng Nghĩa 68
c ph ng pháp nƠy lƠ s d ng t 12 – 18 µl s n ph m PCR (t 57 ng DNA ban
đ u sau 40 chu k khu ch đ i) s cho k t qu d ng t nh v i ph ng pháp RDB.
T l ng DNA b n đ u cho vào s n ph m PCR ch ng t i xác đ nh đ c
m t đ t bào kho ng 105 CFU/ml b n đ u đem đi tách chi t DNA s u đ ti n hành PCR, r i đem s n ph m PCR ti n hành ph n ng lai RDB thì s cho k t qu d ng
Nguy n Tr ng Nghĩa 69
Hình III.28. K t qu minh h a ng ng phát hi n vi khu n c a ph n ng RDB trên m u b nh ph m nhi m Staphylococcus aureus
III.2.8. K t qu phát hi n đ ngth i các ch ng vi hu n gơy b nh
Chúng tôi ti n hành ph n ng PCR – RDB trên d ch m u DNA h n h p c a 3 loài vi khu n (Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus aureus) v i t l
l ng DNA t ng đ ng nh u (kho ng 100ng/µl m i loài). K t qu đi n di s n
ph m PCR và ph n ng l i RDB đ c th hi n hình III.27. và III.28.
K t qu lai t 8µl s n ph m PCR c a m u b nh ph m nhi m Staphylococus aureus
K t qu lai t 12µl s n ph m PCR c a m u b nh ph m nhi m Staphylococus aureus
Nguy n Tr ng Nghĩa 70
Chú thích: Gi ng 1 là s n ph m PCR c a m u h n h p 3 vi khu n ng c u n bp
(+ ) ch ng d ng -) ch ng âm.
Hình III.29. K t qu đi n di s n ph m PCR các m u h n h p 3 loài vi khu n khác nhau
Hình III.30. K t qu lai RDB trên m u h n h p 3 loài vi khu n khác nhau.
500bp 498bp
Nguy n Tr ng Nghĩa 71
PH N IV. K T LU N VẨ NGH
IV.1. K T LU N
Trong quá trình th c hi n đ tài kh lu n t t nghi p này, chúng tôi thu nh n
đ c m t s k t qu nh s u:
Kh o sát đánh giá β b m i vƠ 6 m u d đ c hi u trong vi c phát hi n các
nh m vi khu n gơy b nh th ng g p b o g m: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, và Yersinia enterocolitica.
Th c hi n ph n ng PCR – RDB trên 4 ch ng vi khu n đ i ch ng:
Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica.
T i u h đ c quy trình PCR – RDB tr n các m u b nh ph m: t m đ c
đ nh y t i thi u c ph ng pháp PCR – RDB (xác đ nh ng ng phát hi n
d tr n m t đ t bƠo t ng s 105 CFU/ml vi khu n trong 1 ml m u b nh
ph m).Ch ng t i ti n hƠnh ph n ng PCR –RDB đ ng th i γ/6vi khu n ghi
nh n k t qu ph ng pháp nƠy hoƠn toƠn phù h p vƠ hi u qu trong phát hi n đ ng th i các tác nhơn vi khu n gơy b nh.
Xác đ nh 6 m u b nh ph m d ng t nh v i m u d c ch ng
Staphylococcus aureus trong t ng s 15 m u b nh ph m (m u ch i c y máu)
thu đ c b ng ph ng pháp PCR –RDB k t qu nƠy hoƠn toƠn kh p v i k t
qu đ c ch n đoán lơm sƠng t i b nh vi n.
IV.2. NGH
N u c đi u ki n chúng tôi s ti p t c trên các ch ng vi khu n còn l i (E. coli
O157:H7, V. cholerae), nhi u m u b nh ph m và lo i m u b nh ph m (m u máu, m u phân,..) nh m hoàn thi n quy trình PCR-RDB, kh ng đ nh giá tr khoa h c th c ti n c a quy trình PCR-RDB trong vi c phát hi n đ ng th i các tác nhân gây b nh truy n nhi m c ng nh vi khu n gây b nh đ ng ru t.
Nguy n Tr ng Nghĩa 72
TẨI LI U THAM KH O
TÀI LI U TI NG VI T
[1]. Hà Vinh, (2011), Shigella kháng thu c t i TP H Ch Minh B nh
vi n Nhi t i TP H Ch Minh p c i s y c s 58.
[2]. H Hu nh Thùy D ng, (2008), Sin H c P ân NXB Giáo d c
TP.H Ch Minh.
[3]. Nguy n c L ng (2003), C S Công Ng Vi Sin V t, NXB
Giáo d c TP.H Ch Minh.
[4]. Nguy n H ng Th y Z ch ry W. Bent, (β011) V i tr c YSCW
trong vi c ti t đ c t b i vi sinh v t gơy b nh Yersinia enterocolitica, Khoa Công
ngh th c ph m Tr ng i h c N ng nghi p HƠ N i Vi t N m p c K o
c v P át tri n , T p 9 s 3: 485 – 491.
[5]. Nguy n Th Xuơn Tr ng vƠ c ng s (β01β) T n s xu t hi n Vibrio
cholera tr n t m vƠ nhuy n th xác đ nh serotype O1 O1γ9 vƠ biotype c V. cholera b ng k thu t Multiplex-PCR, p c K o c k t u t t y s γ tr ng
19.
[6]. Tr n Ng c B ch, (β01β) T l nhi m vi khu n Salmonella tr n th y
c m vƠ s n ph m th y c m t i t nh H u Gi ng Kho N ng nghi p vƠ Sinh h c ng
d ng Tr ng i h c C n Th p c K o c r ng i c C n , s
23a, trang 235-242.
[7]. Tr n Th H ng Gi ng Hu nh Th M L (β01β) Xác đ nh t l vƠ
đ c l c c vi khu n Escherichia coli phơn l p đ c t th t (l n b gƠ) m t s
huy n ngo i thƠnh HƠ N i Kho Th y Tr ng i h c N ng nghi p HƠ N i p
c K o c v P át tri n r ng i c Nông Ng i p H N i T p 10 s
2: 295 – 300.
TÀI LI U TI NG ANH
[8]. Amit Kumar, Ajay Kumar, Vandana Kaushal, Sandip Patil, Chandani Payal, Anil Kumar, (2011), Antibacterial potential of some natural food
Nguy n Tr ng Nghĩa 73 preservatives against Staphylococcus aureus isolated from various food samples of himachal pradesh (India), World Journal of Science and Technology 2011, 1(10): 48-53.
[9]. Anthony RM, Brown TJ, French GL, (2000), Rapid diagnosis of bacteremia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array, J Clin Microbiol, 38(2):781-788.
[10]. Arun, Bhunia K, 2008, Foodborne Microbial Pathogens, Food Science Text Series.
[11]. Ballmer K, Korczak BM, Kuhnert P, Slickers P, Ehricht R, Hächler H, (2007), Fast DNA Serotyping of Escherichia coli by Use of an Oligonucleotide Microarray, J Clin Microbiol, 45(2):370-379.
[12]. Bartlett J.M.S., Sterling D.,(2004). Methods in Molecular Biology, PCR Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ. 226: 337 – 340.
[13]. Bavykin SG, Lysov YP, Zakhariev V, Kelly JJ, Jackman J, Stahl DA, Cherni A, (2004), Use of 16S rRNA, 23S rRNA, and gyrB gene sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus group microorganisms, J Clin Microbiol., 42(8):3711-3730.
[14]. Bottone EJ., (1997), Yersinia enterocolitica: the charisma continues, Clin Microbiol Rev., 10(2):257-276.
[15]. Bruant G, Maynard C, Bekal S, Gaucher I, Masson L, Brousseau R, Harel J, (2006), Development and validation of an oligonucleotide microarray for detection of multiple virulence and antimicrobial resistance genes in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol., 72(5):3780-3784.
[16]. Chakravorty S, Helb D, Burday M, Connell N, Alland D, (2012), A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria., J Microbiol Methods., 69(2):330-339.
[17]. Chiang YC, Yang CY, Li C, Ho YC, Lin CK, Tsen HY, Identification of Bacillus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp. and Vibrio spp. with 16S ribosomal DNA-based oligonucleotide array hybridization, Int J Food Microbiol, 107(2):131-137.
Nguy n Tr ng Nghĩa 74 [18]. Chiba N, Murayama SY, Morozumi M, Nakayama E, Okada T, Iwata S, Sunakawa K, Ubukata K, (2009), Rapid detection of eight causative pathogens