Qua tham khảo các nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới, chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình sau:
Quy trình 1 (tham khảo Joon Hyuk Suh và cộng sự) Cân 1g mẫu bột vào ống ly tâm 50ml
Thêm 4 ml nƣớc 18MΩ, lắc xoáy 1 phút ở nhiệt độ phòng
Thêm 12 ml acetonitrile, lắc đều
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút
Hút 10 ml dịch trong vào ống ly tâm 50ml Thổi khô dung môi bằng khí nitơ đến khoảng 2ml
Thêm pha động A đến 5ml
Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào HPLC
Quy trình 2 (tham khảo Soledad Albalá-Hurtado cùng cộng sự) Cân 1g mẫu bột vào ống thủy tinh 15ml
Thêm 4ml nƣớc 18MΩ, lắc xoáy 1 phút
Thêm 1ml TCA 20%, lắc xoáy 1 phút
↓
Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút
Lọc. Rửa tủa và định mức bằng pha động A vừa đủ 10 ml. Hút 1ml dịch + 1ml pha động A
Trộn đều, lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào HPLC
Kết quả độ nồng độ các vitamin thu đƣợc từ 2 quy trình xử lý mẫu đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1:Nồng độ của các vitamin với mỗi quy trình.
Nồng độ (mg/100g) Viamin
Quy trình 1 Quy trình 2 Mẫu QC
B1 0,960 1,558 1,257
B2 1,473 1,376 2,037
B6 1,347 1,435 1,346
B9 0 0,145 0,2293
Nhận xét:
Mẫu QC sau khi xử lý bằng quy trình 1, 2 đem phân tích bằng phƣơng pháp HPLC đều cho pic các vitamin tách rời hoàn toàn khỏi các pic tạp.
Quy trình 1 không phân tích đƣợc vitamin B9. Quy trình 2 phân tích đƣợc đồng thời cả 4 vitamin, tuy nhiên nồng độ vitamin B2 và B9 thu đƣợc thấp hơn so với hàm lƣợng thực trong QC.
Do vậy chúng tôi lựa chọn quy trình 2 và tiếp tục khảo sát xử lý các điều kiện chiết xuất: thể tích TCA 20%, cách lắc chiết, thời gian chiết để tối ƣu quy trình xử lý mẫu.
Khảo sát thể tích TCA 20%:
Mục đích sử dụng dung dịch TCA là để kết tủa protein trong mẫu nhằm làm sạch mẫu, thuận lợi cho quá trình phân tích bằng HPLC.
Chúng tôi khảo sát 4 thể tích TCA 20%: 0.5ml; 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2:Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau. Thê tích TCA 20% (ml) Nồng độ (mg/100g) 0,5 1 1,5 2 3 Vitamin B1 1,537 1,519 1,441 1,503 1,523 1,501 1,498 1,429 1,553 1,494 1,432 1,473 1,553 1,510 1,557 1,624 1,466 1,508 1,570 1,508 1,670 1,528 1,528 1,504 1,601 1,588 1,494 1,501 Vitamin B2 1,350 1,471 1,486 1,455 1,520 1,347 1,426 1,432 1,603 1,594 1,366 1,444 1,553 1,506 1,647 1,582 1,434 1,536 1,581 1,567 1,570 1,476 1,577 1,615 1,503 1,545 1,444 1,541 Vitamin B6 1,401 1,436 1,326 1,409 1,387 1,391 1,394 1,295 1,417 1,392 1,320 1,382 1,458 1,384 1,399 1,496 1,323 1,381 1,399 1,372 1,532 1,380 1,389 1,389 1,465 1,435 1,367 1,384 Vitamin B9 0,099 0,187 0,143 0,163 0,154 0,118 0,150 0,129 0,147 0,168 0,135 0,137 0,137 0,141 0,179 0,105 0,139 0,134 0,150 0,147 0,108 0,120 0,121 0,142 0,118 0,131 0,129
Với mỗi vitamin, so sánh nồng độ thu đƣợc giữa 5 cách sử dụng thể tích TCA 20% khác nhau, chúng tôi sử dụng hàm ANOVA-test và T-test trên phần mềm GraphPad Prism. Kết quả:
- Khi dùng hàm ANOVA-test: giá trị p-value của các vitamin đều lớn hơn 0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
- Khi dùng hàm T-test:
Vitamin B9: Khi so sánh giữa các thể tích 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml cho giá trị p-value > 0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Khi so sánh giữa cặp thể tích 0,5ml và 1ml TCA 20% cho giá trị p-value = 0,0082< 0,05: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nhìn bảng 3.2 ta thấy khi dùng thể tích 0,5 ml TCA 20% cho nồng độ B9 thấp hơn các thể tích khác.
Các giá trị p-value của các vitamin còn lại đều lớn hơn 0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
Nhận xét:Kết quả khảo sát cho thấy:
- Với các vitamin B1, B2, B6: không có sự khác biệt khi sử dụng các thể tích TCA 20% là 0,5ml; 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml.
- Với vitamin B9: không có sự khác biệt khi sử dụng các thể tích TCA 20% là 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml. Nhƣng khi dùng 0,5ml TCA 20% thì thu đƣợc nồng độ B9 nhỏ hơn các thể tích khác.
Vậy để phân tích tối ƣu cả 4 vitamin đồng thời tiết kiệm dung môi, chúng tôi chọn thể tích TCA 20% là 1ml cho các khảo sát tiếp theo.
Khảo sát cách lắc mẫu.
Lắc mẫu có tác dụng tăng độ hòa tan của các vitamin trong dung môi chiết. Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 cách lắc: siêu âm, lắc ngang, lắc xoáy. Mỗi cách lắc, tiến hành hai mẫu độc lập.
Bảng 3.3: Nồng độ của các vitamin với mỗi cách lắc khác nhau.
Cách lắc Nồng độ
(mg/100g)
Siêu âm Lắc ngang Lắc xoáy
B1 1,469 1,486 1,503 1,490 1,480 1,480 B2 1,430 1,444 1,474 1,473 1,472 1,459 B6 1,398 1,389 1,389 1,403 1,396 1,391 B9 0,136 0,136 0,141 0,141 0,143 0,137
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy, ba cách lắc cho nồng độ của các vitamin tƣơng đƣơng nhau. Siêu âm và lắc ngang có thể làm đồng thời nhiều mẫu hơn so với lắc xoáy do đó tiết kiệm thời gian chiết. Chúng tôi lựa chọn cách siêu âm cho các khảo sát tiếp theo.
Khảo sát thời gian chiết:
Chúng tôi tiến hành khảo sát các thời gian siêu âm là 5, 10, 15, 20, 30, 60 phút. Mỗi khoảng thời gian, tiến hành ba mẫu độc lập. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4:Nồng độ của các vitamin với thời gian siêu âm khác nhau.
Thời gian Nồng độ (mg/100g) 5 phút 10 phút 15 phút 20 phút 30 phút 60 phút B1 1,516 1,570 1,561 1,488 1,521 1,572 1,498 1,606 1,518 1,335 1,401 1,330 1,526 1,505 1,508 1,159 1,432 1,234 B2 1,392 1,491 1,446 1,429 1,442 1,432 1,387 1,521 1,483 1,279 1,298 1,285 1,480 1,470 1,440 0,990 1,345 1,206 B6 1,403 1,433 1,389 1,374 1,410 1,425
1,234 1,409 1,395 1,203 1,286 1,201 1,324 1,399 1,399 0,954 1,337 1,157 B9 0,112 0,117 0,118 0,124 0,127 0,130 0,149 0,149 0,129 0,105 0,132 0,121 0,137 0,145 0,122 0,095 0,106 0,116
Với mỗi vitamin, so sánh nồng độ thu đƣợc giữa các thời gian siêu âm khác nhau, chúng tôi sử dụng hàm ANOVA-test, T-test trên phần mềm GraphPad Prism. Kết quả giá trị p-value của các vitamin đều lớn hơn 0,05 cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Do vậy chúng tôi chọn thời gian siêu âm ngắn nhất là 5 phút.
Từ các kết quả khảo sát thu được, chúng tôi lựa chọn được các điều kiện xử lý mẫu như sau:
Lựa chọn quy trình 2 để xử lý mẫu.
Sử dụng 1ml TCA 20% để kết tủa protein trong mẫu.
Lựa chọn cách lắc siêu âm để tăng hòa tan các vitamin.
Lựa chọn thời gian siêu âm 5 phút.