Hiện nay, glucosamin đã được cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA) xếp vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp.Đặt mối quan tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt chất này, đề tài này được thực hiện nhằm mục đích đưa ra một quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSAMIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA
Nguyễn Lục Thơ*, Nguyễn Thị Chung**, Nguyễn Đức Tuấn***
TÓM TẮT
Mục tiêu: Hiện nay, glucosamin đã được Cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA) xếp vào danh
mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp.Đặt mối quan tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt chất này, đề tài này được thực hiện nhằm mục đích đưa ra một quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh
Glucosamin được định lượng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo, đầu dò PDA Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đãđược khảo sát như tốc độ dòng, thành phần và tỷ lệ dung môi pha động
Kết quả: Đã xây dựng được quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC, sử
dụng cột Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm), pha động gồm acetonitril – đệm phosphat pH 3 có triethylamin (35:65, tt/tt), bước sóng phát hiện 195 nm, tốc độ dòng 0,5 ml/phút Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định lượng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng từ 600 – 1400 µg/ml, độ đúng thể hiện qua tỷ lệ hồi phục nằm trong khoảng 98% - 102% và RSD < 2% đối với độ chính xác
Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình HPLC định lượng glucosamin Quy trình đã được áp
dụng để định lượng glucosamin trong viên glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh và trong thử nghiệm độ hòa tan
Từ khóa: Glucosamin, sắc ký lỏng hiệu năng cao
ABSTRACT
QUANTITATIVE DETERMINATION OF GLUCOSAMINE
BY HPLC WITH PDA DETECTOR
Nguyen Luc Tho, Nguyen Thi Chung, Nguyen Duc Tuan
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No 4 - 2013: 157 - 161
Objective: Currently, glucosamine has been approved as a drug for improving arthritis by the European
Agency for Evaluation of Medicinal Products (EMEA) The aim of the study was to develop a HPLC -PDA method for quantitative determination of glucosamine
Subjects and Methods: The subject of this study was glucosamine sulfate 750 mg fast-release coated-film
tablets Several chromatographic conditions such as mobile phase and flow rate were investigated to improve the column efficiency and selectivity
Results: The appropriate chromatographic conditions were found out for quantitative determination of
glucosamine, using an Ascentic RP C8 column (250 x 4.6 mm; 5 μm), mixture of acetonitrile and phosphate buffer pH 3.0 containing triethylamine (35:65, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 0.5 ml/min., and detection wavelength of 195 nm The method was shown high selectivity, wide linearity range from 600 to 1,400
* Sở Y tế Đồng Nai ** Hội Dược học TP Hồ Chí Minh
*** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Trang 2μg mL −1 Intra-day relative standard deviation was below 2% and the recovery range was 98% - 102%
Conclusion: A simple liquid chromatographic method was successfully developed for quantitative
determination of glucosamine The validated method was applied for quantitative determination of glucosamine in glucosamine sulfate 750 mg fast-release tablet, and of glucosamine released from dissolution test
Key words: Glucosamine, HPLC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh xương khớp đang là vấn đề lớn của xã
hội vì nó có thể làm người bệnh tàn phế, suy
giảm sức lao động Trong nhiều thập niên qua,
việc điều trị viêm khớp chủ yếu là dùng các
thuốc kháng viêm giảm đau nhằm mục đích
giảm các triệu chứng đau và hạn chế vận động
khớp viêm cho người bệnh.Tuy nhiên những
thuốc này có rất nhiều tác dụng phụ và thường
không cải thiện được tình trạng bệnh lý của sụn
khớp bị hư hỏng Theo khuyến cáo của Cơ quan
đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA),
glucosamin được xem là thuốc có hiệu quả và có
nhiều ưu điểm hơn các thuốc kháng viêm
non-steroid do có rất ít tác dụng phụ Đặt mối quan
tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn
nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt
chất này, vì vậy đề tài này được thực hiện nhằm
mục đích đưa ra một quy trình định lượng
glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử
độ hòa tan
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg
(tương đương với glucosamin sulfat kali clorid
1000 mg) giải phóng nhanh, số lô: 121009, hạn
dùng: 10/2012, nhà sản xuất: Ampharco (USA)
Trang thiết bị, hóa chất, dung môi
Trang thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters
Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996 Cân
phân tích Sartorius BP221S Máy đo pH
Metrohm 744 Bể siêu âm Elma
Hóa chất, dung môi
Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký
lỏng (Merck).Acid phosphoric, kali hydroxyd,
triethylamin đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck)
Phương pháp nghiên cứu
Dựa vào cấu trúc glucosamin là một base hữu cơ và tham khảo chuyên luận glucosamin trong Dược điển Việt Nam IV (1), kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo được áp dụng với pha động bao gồm dung dịch đệm phosphat pH 3 và acetonitril, sắc ký đồ được ghi tại bước sóng 195
nm Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách và độ chọn lọc của phương pháp đã được khảo sát như tốc độ dòng,
tỷ lệ dung môi pha động, thêm vào pha động triethylamin (TEA) để cải thiện hệ số đối xứng của pic glucosamin Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, sẽ tiến hành thẩm định quy trình theo hướng dẫn của ICH (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng Sau khi được thẩm định, quy trình này sẽ được ứng dụng để định lượng glucosamin trong viên glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh và trong thử nghiệm độ hòa tan
Chuẩn bị mẫu và dung dịch đệm
Dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác 100 mg
glucosamin HCl, cho vào bình định mức 100 ml Thêm khoảng 65 ml nước, siêu âm 5 phút Thêm nước vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm
Dung dịch mẫu thử:Lấy 20 viên bao phim bất
kỳ, lột bỏ màng bao, cân khối lượng viên nhân, nghiền mịn, trộn đều, tính khối lượng trung bình
1 viên nhân Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng 125 mg glucosamin sulfat kali clorid, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml nước, siêu âm 10 phút Thêm nước đến vạch, lắc đều, lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc tiếp qua màng lọc 0,45 µm
Trang 3Mẫu trắng: Mẫu trắng 1: pha động; Mẫu
trắng 2: mẫu giả dược (chuẩn bị tương tự dung
dịch mẫu thử nhưng không có glucosamin)
Dung dịch đệm phosphat pH 3: lấy chính xác
0,5 ml acid phosphoric đậm đặc, pha loãng trong
1000 ml nước cất, điều chỉnh đến pH 3 bằng
dung dịch kali hydroxyd 30%, lọc qua màng lọc
0,45 µm
Dung dịch đệm phosphat pH 3 có triethylamin:
lấy chính xác 0,5 ml acid phosphoric đậm đặc,
pha loãng trong 1000 ml nước cất, điều chỉnh
đến pH 3 bằng dung dịch kali hydroxyd 30%,
thêm tiếp 2,1 ml triethylamin, tiếp tục điều chỉnh
đến pH 3 bằng dung dịch acid phosphoric 1%,
lọc qua màng lọc 0,45 µm
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thăm dòđiều kiện sắc ký
Trong các điều kiện sắc ký khảo sát, hai điều kiện ảnh hưởng đến thời gian lưu và hệ số đối xứng của pic glucosamin được trình bày trong bảng 1 Hình 1 và hình 2 minh họa sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn khi tiến hành sắc ký theo hai điều kiện này
Bảng 1: Hai điều kiện sắc ký khảo sát
phosphat pH 3 (35:65, tt/tt)
Acetonitril: đệm phosphat pH 3 có triethylamin (35:65, tt/tt) Thời gian lưu
(phút)
Hệ số đối xứng pic glucosamin
Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với điều kiện 1
Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với điều kiện 2
Nhận xét: Thời gian lưu của glucosamin hầu
như không thay đổi ở cả 2 điều kiện Với điều
kiện 1, hệ số đối xứng của pic glucosamin có giá
trị 1,6 Với điều kiện 2 (có thêm TEA), hệ số đối
xứng được cải thiện đáng kể, có giá trị 1,2 Như
vậy điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng
glucosamin sulfat kali clorid như sau:
Pha động: dung dịch đệm phosphat pH 3 có
TEA: acetonitril (65:35, tt/tt) Cột sắc ký: Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút Đầu dò PDA: 195 nm Thể tích bơm mẫu: 10 µl
Thẩm định phương pháp
Trang 4Khảo sát tính phù hợp của hệ thống
Bảng 2:Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6)
Chuẩn
Thử
t R : thời gian lưu, S: diện tích pic, A s : hệ số đối xứng, N: số đĩa lý thuyết
Nhận xét: Hệ số đối xứng có giá trị trung bình
trong khoảng 0,8 – 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối
(RSD) của các thông số sắc ký cho các lần tiêm
lặp lại của mẫu chuẩn và mẫu thử đều nhỏ hơn
2%.Vậy quy trình định lượngglucosamin đạt
tính phù hợp của hệ thống
Tính chọn lọc
Hình 3 minh họa sắc ký đồ pha động, mẫu
giả dược, mẫu chuẩn và mẫu thử Kết quả khảo
sát tính chọn lọc cho thấy: thời gian lưu của pic
hoạt chất trong mẫu thử tương đương với thời
gian lưu của pic glucosamin trong mẫu chuẩn,
đồng thời mẫu trắng và mẫu giả dược không có pic trùng với pic glucosamin Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic glucosamin tăng lên so với trước khi thêm chuẩn.Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic glucosamin trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic glucosamin trong mẫu chuẩn Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic của đầu dò PDA cho thấy pic glucosamin không có các thành phần khác trong tất cả các mẫu Như vậy, qui trình định lượng glucosamin
có tính chọn lọc
Hình 3:Sắc ký đồ pha động (a), mẫu giả dược (b) mẫu chuẩn (c), mẫu thử (d)
Độ đúng, độ chính xác và khoảng tuyến
tính
Kết quả thống kê cho thấy qui trình phân
tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương
102% và RSD < 2% đối với độ chính xác
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác và
khoảng tuyến tính
Trang 5Ứng dụng quy trình định lượng
glucosamin trong viên nén glucosamin
sulfat 750 mg giải phóng nhanh và trong
thử nghiệm độ hòa tan
Quy trình phân tích sau khi thẩm định đã
được ứng dụng để định lượng glucosamin sulfat
kali clorid trong 3 lô pilot và trong thử nghiệm
độ hòa tan sau 10 phút
Glucosamin sulfat kali clorid được hòa tan
trên 85% sau 10 phút ở cả 3 lô thuốc.Với chỉ tiêu
định lượng, cả 3 lô đều có hàm lượng
glucosamin sulfat kali clorid nằm trong khoảng
từ 90% - 110% so với hàm lượng ghi trên nhãn
Bảng 4: Kết quả định lượng và thử nghiệm độ hòa
tan trên 3 lô thành phẩm (n=6)
với nhãn
KẾT LUẬN
Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang, chúng tôi đã xây dựng được quy trình định lượng glucosamin Phương pháp đạt tính phù hợp của hệ thống, có tính chọn lọc, độ chính xác và độ đúng cao, khoảng tuyến tính rộng.Quy trình này có thể được ứng dụng để định lượng glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học,
Hà Nội, 289-292
2 ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical proceduces: text and methodology, 1-13
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013