Hiện nay, glucosamin đã được cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA) xếp vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp.Đặt mối quan tâm đến một hoạt chất mới và mong muốn nghiên cứu một phương pháp định lượng hoạt chất này, đề tài này được thực hiện nhằm mục đích đưa ra một quy trình định lượng glucosamin trong chế phẩm và trong phép thử độ hòa tan.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSAMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA Nguyễn Lục Thơ*, Nguyễn Thị Chung**, Nguyễn Đức Tuấn*** TÓM TẮT Mục tiêu: Hiện nay, glucosamin Cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA) xếp vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc bệnh viêm khớp.Đặt mối quan tâm đến hoạt chất mong muốn nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất này, đề tài thực nhằm mục đích đưa quy trình định lượng glucosamin chế phẩm phép thử độ hòa tan Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh Glucosamin định lượng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo, đầu dò PDA Trong trình thực nghiệm, yếu tố ảnh hưởng đến hiệu tách độ chọn lọc phương pháp đãđược khảo sát tốc độ dòng, thành phần tỷ lệ dung môi pha động Kết quả: Đã xây dựng quy trình định lượng glucosamin chế phẩm phương pháp HPLC, sử dụng cột Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; μm), pha động gồm acetonitril – đệm phosphat pH có triethylamin (35:65, tt/tt), bước sóng phát 195 nm, tốc độ dòng 0,5 ml/phút Kết thẩm định cho thấy quy trình định lượng có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng từ 600 – 1400 µg/ml, độ thể qua tỷ lệ hồi phục nằm khoảng 98% - 102% RSD < 2% độ xác Kết luận: Đề tài xây dựng thành cơng quy trình HPLC định lượng glucosamin Quy trình áp dụng để định lượng glucosamin viên glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh thử nghiệm độ hòa tan Từ khóa: Glucosamin, sắc ký lỏng hiệu cao ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF GLUCOSAMINE BY HPLC WITH PDA DETECTOR Nguyen Luc Tho, Nguyen Thi Chung, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 157 - 161 Objective: Currently, glucosamine has been approved as a drug for improving arthritis by the European Agency for Evaluation of Medicinal Products (EMEA) The aim of the study was to develop a HPLC-PDA method for quantitative determination of glucosamine Subjects and Methods: The subject of this study was glucosamine sulfate 750 mg fast-release coated-film tablets Several chromatographic conditions such as mobile phase and flow rate were investigated to improve the column efficiency and selectivity Results: The appropriate chromatographic conditions were found out for quantitative determination of glucosamine, using an Ascentic RP C8 column (250 x 4.6 mm; μm), mixture of acetonitrile and phosphate buffer pH 3.0 containing triethylamine (35:65, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 0.5 ml/min., and detection wavelength of 195 nm The method was shown high selectivity, wide linearity range from 600 to 1,400 * ** Sở Y tế Đồng Nai Hội Dược học TP Hồ Chí Minh *** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Lục Thơ - ĐT: 0913799068 Email:diemnhim@yahoo.com Chuyên Đề Dược Học 157 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 μg mL−1 Intra-day relative standard deviation was below 2% and the recovery range was 98% - 102% Conclusion: A simple liquid chromatographic method was successfully developed for quantitative determination of glucosamine The validated method was applied for quantitative determination of glucosamine in glucosamine sulfate 750 mg fast-release tablet, and of glucosamine released from dissolution test Key words: Glucosamine, HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh xương khớp vấn đề lớn xã hội làm người bệnh tàn phế, suy giảm sức lao động Trong nhiều thập niên qua, việc điều trị viêm khớp chủ yếu dùng thuốc kháng viêm giảm đau nhằm mục đích giảm triệu chứng đau hạn chế vận động khớp viêm cho người bệnh.Tuy nhiên thuốc có nhiều tác dụng phụ thường không cải thiện tình trạng bệnh lý sụn khớp bị hư hỏng Theo khuyến cáo Cơ quan đánh giá Dược phẩm châu Âu (EMEA), glucosamin xem thuốc có hiệu có nhiều ưu điểm thuốc kháng viêm nonsteroid có tác dụng phụ Đặt mối quan tâm đến hoạt chất mong muốn nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất này, đề tài thực nhằm mục đích đưa quy trình định lượng glucosamin chế phẩm phép thử độ hòa tan ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg (tương đương với glucosamin sulfat kali clorid 1000 mg) giải phóng nhanh, số lơ: 121009, hạn dùng: 10/2012, nhà sản xuất: Ampharco (USA) Trang thiết bị, hóa chất, dung mơi Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996 Cân phân tích Sartorius BP221S Máy đo pH Metrohm 744 Bể siêu âm Elma Hóa chất, dung mơi Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng sắc ký lỏng (Merck).Acid phosphoric, kali hydroxyd, 158 triethylamin đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) Phương pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc glucosamin base hữu tham khảo chuyên luận glucosamin Dược điển Việt Nam IV (1), kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo áp dụng với pha động bao gồm dung dịch đệm phosphat pH acetonitril, sắc ký đồ ghi bước sóng 195 nm Trong q trình thực nghiệm, yếu tố ảnh hưởng đến hiệu tách độ chọn lọc phương pháp khảo sát tốc độ dòng, tỷ lệ dung mơi pha động, thêm vào pha động triethylamin (TEA) để cải thiện hệ số đối xứng pic glucosamin Sau tìm điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình theo hướng dẫn ICH (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ xác, độ Sau thẩm định, quy trình ứng dụng để định lượng glucosamin viên glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh thử nghiệm độ hòa tan Chuẩn bị mẫu dung dịch đệm Dung dịch mẫu chuẩn: cân xác 100 mg glucosamin HCl, cho vào bình định mức 100 ml Thêm khoảng 65 ml nước, siêu âm phút Thêm nước vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm Dung dịch mẫu thử:Lấy 20 viên bao phim bất kỳ, lột bỏ màng bao, cân khối lượng viên nhân, nghiền mịn, trộn đều, tính khối lượng trung bình viên nhân Cân xác lượng bột thuốc tương ứng 125 mg glucosamin sulfat kali clorid, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml nước, siêu âm 10 phút Thêm nước đến vạch, lắc đều, lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc tiếp qua màng lọc 0,45 µm Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Mẫu trắng: Mẫu trắng 1: pha động; Mẫu trắng 2: mẫu giả dược (chuẩn bị tương tự dung dịch mẫu thử khơng có glucosamin) Dung dịch đệm phosphat pH 3: lấy xác 0,5 ml acid phosphoric đậm đặc, pha loãng 1000 ml nước cất, điều chỉnh đến pH dung dịch kali hydroxyd 30%, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch đệm phosphat pH có triethylamin: lấy xác 0,5 ml acid phosphoric đậm đặc, pha loãng 1000 ml nước cất, điều chỉnh đến pH dung dịch kali hydroxyd 30%, thêm tiếp 2,1 ml triethylamin, tiếp tục điều chỉnh đến pH dung dịch acid phosphoric 1%, lọc qua màng lọc 0,45 µm Nghiên cứu Y học Thăm dòđiều kiện sắc ký Trong điều kiện sắc ký khảo sát, hai điều kiện ảnh hưởng đến thời gian lưu hệ số đối xứng pic glucosamin trình bày bảng Hình hình minh họa sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn tiến hành sắc ký theo hai điều kiện Bảng 1: Hai điều kiện sắc ký khảo sát Pha động Thời gian lưu (phút) Hệ số đối xứng pic glucosamin Điều kiện Điều kiện Acetonitril: đệm Acetonitril: đệm phosphat pH phosphat pH có (35:65, tt/tt) triethylamin (35:65, tt/tt) 5,173 5,216 1,6 1,2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với điều kiện Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với điều kiện Nhận xét: Thời gian lưu glucosamin không thay đổi điều kiện Với điều kiện 1, hệ số đối xứng pic glucosamin có giá trị 1,6 Với điều kiện (có thêm TEA), hệ số đối xứng cải thiện đáng kể, có giá trị 1,2 Như điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng glucosamin sulfat kali clorid sau: TEA: acetonitril (65:35, tt/tt) Cột sắc ký: Ascentic RP C8 (250 x 4,6 mm; µm) Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút Đầu dò PDA: 195 nm Thể tích bơm mẫu: 10 µl Pha động: dung dịch đệm phosphat pH có Thẩm định phương pháp Chuyên Đề Dược Học 159 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 2:Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống (n=6) Mẫu Chuẩn Thử Giá trị thống kê Trung bình SD RSD Xtb SD RSD tR (phút) 5,204 0,003 0,05% 5,033 0,002 0,05% S (µAU x giây) 1318685 8515 0,65% 1043176 13391 1,28% As 1,2 0,0 0,51% 1,2 0,0 1,17% N 11756 18 0,62% 11628 42 1,46% tR: thời gian lưu, S: diện tích pic, As: hệ số đối xứng, N: số đĩa lý thuyết đồng thời mẫu trắng mẫu giả dược khơng có pic trùng với pic glucosamin Khi thêm lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao diện tích pic glucosamin tăng lên so với trước thêm chuẩn.Phổ UV-Vis thời gian lưu pic glucosamin mẫu thử giống phổ UV-Vis thời gian lưu pic glucosamin mẫu chuẩn Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic đầu dò PDA cho thấy pic glucosamin khơng có thành phần khác tất mẫu Như vậy, qui trình định lượng glucosamin có tính chọn lọc Nhận xét: Hệ số đối xứng có giá trị trung bình khoảng 0,8 – 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thông số sắc ký cho lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn mẫu thử nhỏ 2%.Vậy quy trình định lượngglucosamin đạt tính phù hợp hệ thống Tính chọn lọc Hình minh họa sắc ký đồ pha động, mẫu giả dược, mẫu chuẩn mẫu thử Kết khảo sát tính chọn lọc cho thấy: thời gian lưu pic hoạt chất mẫu thử tương đương với thời gian lưu pic glucosamin mẫu chuẩn, (a) (b) (c) (d) Hình 3:Sắc ký đồ pha động (a), mẫu giả dược (b) mẫu chuẩn (c), mẫu thử (d) 102% RSD < 2% độ xác Độ đúng, độ xác khoảng tuyến Bảng 3: Kết khảo sát độ đúng, độ xác tính khoảng tuyến tính Kết thống kê cho thấy qui trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao, tỷ lệ hồi phục nằm khoảng 98% - 160 Chỉ tiêu thẩm định Phương trình hồi qui Giá trị thống kê y = 1379,5x – 59340; R = Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Khoảng tuyến tính (µg/ml) Độ lặp lại (n=6) Độ xác liên ngày (n=18) Độ (tỷ lệ hồi phục, n=9) 0,9999 600 - 1400 RSD = 1,71% RSD = 0,45% 99,9% - 101,1 % Ứng dụng quy trình định lượng glucosamin viên nén glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh thử nghiệm độ hòa tan Quy trình phân tích sau thẩm định ứng dụng để định lượng glucosamin sulfat kali clorid lô pilot thử nghiệm độ hòa tan sau 10 phút Glucosamin sulfat kali clorid hòa tan 85% sau 10 phút lô thuốc.Với tiêu định lượng, lô có hàm lượng glucosamin sulfat kali clorid nằm khoảng từ 90% - 110% so với hàm lượng ghi nhãn Bảng 4: Kết định lượng thử nghiệm độ hòa tan lơ thành phẩm (n=6) Chỉ tiêu Phần trăm glucosamin sulfat kali clorid so với nhãn Chuyên Đề Dược Học Độ hòa tan Định lượng Nghiên cứu Y học Lô 91,39% 99,59% Lô 91,36% 99,72% Lô 91,12% 101,33% KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò dãy diod quang, chúng tơi xây dựng quy trình định lượng glucosamin Phương pháp đạt tính phù hợp hệ thống, có tính chọn lọc, độ xác độ cao, khoảng tuyến tính rộng.Quy trình ứng dụng để định lượng glucosamin chế phẩm phép thử độ hòa tan TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 289-292 ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical proceduces: text and methodology, 1-13 Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 161 ... 91,36% 99,72% Lô 91,12% 101,33% KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò dãy diod quang, xây dựng quy trình định lượng glucosamin Phương pháp đạt tính phù hợp hệ thống, có tính... 101,1 % Ứng dụng quy trình định lượng glucosamin viên nén glucosamin sulfat 750 mg giải phóng nhanh thử nghiệm độ hòa tan Quy trình phân tích sau thẩm định ứng dụng để định lượng glucosamin sulfat... đích đưa quy trình định lượng glucosamin chế phẩm phép thử độ hòa tan ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Viên nén bao phim glucosamin sulfat 750 mg (tương đương với glucosamin