xây dựng quy trình tạo b cyclodextrin bằng phương pháp enzyme

i ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu) XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO β-CYCLODEXTRIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP ENZYM CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2012 ii TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU β-cyclodextrin (β-CD), oligosac α-1-4 glycosid, đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm và nông nghiệp. β- enzym cyclodextrin glucanotransferase β- - - . Trong báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu quy trình tạo β- CD với CGTase (Toruzyme 3.0L) cố định trên các chất mang khác nhau nhƣ Al 2 O 3 , Q-Sepharose, Purolite, Eupergit C, chitosan và alginat với cơ chất là tinh bột sắn và dịch xử lý tinh bột sắn với Termamyl 120L. Kết quả cho thấy, quy trình tạo β-CD tối ƣu với CGTase cố định trên alginat (33,16 U/g chất mang) là dịch xử lý tinh bột sắn 26% (từ tinh bột sắn 40%), thời gian 61 h, lƣợng enzym 2,91KU/L với hiệu suất chuyển đổi là 34%, độ tinh khiết 98%. Sản phẩm β-CD thu đƣợc có độc tính cấp >10.000 mg/ kg thể trọng chuật và đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng. iii SUMMARY OF RESEARCH CONTENT β- cyclodextrins, cyclic oligosaccharide composed of 7 α-1,4-linked glucose units, is widely used in food, pharmaceutical, cosmetic, and agricultural industries. They are produced by the catalytic action of cyclodextrin glucanotransferase. The enzyme displays its cyclic action on substrates with α-1,4-glycosyl chain, such as starch, amylose, amylopectin, dextrins, matodextrins, or glycogen. In this study, Conditions of β-CD production from cassava starch and hydrolyzed cassava starch (with Termamyl 120L) with immobilized CGTase on different carriers such as Al 2 O 3 , Q-Sepharose, Purolite, Eupergit C, chitosan và alginat were investigated. The result showed that the optimal conditions of β-CD production on hydrolyzed starch with immobilized CGTase on alginate (33.16 U/g carrier) were hyrolyzed starch 26% (from cassava 40%), reaction time 61h, enzym CGTase concentration 2,91 KU/L with convertion yield to β-CD was 34% and β-CD purity was higher than 98%. And, acute toxicity of β-CD product was higher than 10.000 mg/ kg body of mice and this product met pharmaceutical standards. iv MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ii SUMMARY OF RESEARCH CONTENT iii viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BẢNG x MỞ ĐẦU xii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Cyclodextrin và sản xuất cyclodextrin 2 1.1.1. Lịch sử phát triển cyclodextrin 2 1.1.2. Cấu trúc của cyclodextrin 3 1.1.3. Tính chất 4 1.1.4. Độc tính của các CD 8 1.1.5. Ứng dụng 10 1.1.6. CGTase 12 13 : 14 1.1.9. Sản xuất CD 14 1.2. Enzym cố định 17 1.2.1. Khái niệm 17 1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định 18 1.2.3. Phƣơng pháp cố định enzym 19 1.3. Tình hình nghiên cứu 22 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc: 22 v 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc: 23 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1. Cố định CGTase trên giá mang rắn 25 2.1.1. Mô tả nội dung: 25 2.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.1.3. Các chỉ tiêu theo dõi: 36 2.1.4. Sản phẩm nội dung cần đạt: 37 2.2. Thăm dò các thông số của phản ứng tạo β-CD 37 2.2.1. Mô tả nội dung: 37 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 37 β-CD theo Kaneko 38 2.2.4. Các chỉ tiêu theo dõi 39 2.2.5. Sản phẩm nội dung cần đạt 39 2.3. Tối ƣu hóa quy trình tạo β-CD thô 39 2.3.1. Mô tả nội dung: 39 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 39 2.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi 41 2.3.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 42 2.4. Xây dựng quy trình tinh chế sản phẩm 42 2.4.1. Mô tả nội dung: 42 2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 42 2.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi 45 2.4.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 45 2.5. Xây dựng quy trình thu hồi enzym và dung môi 45 2.5.1. Mô tả nội dung: 45 2.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 45 vi 2.5.3. Các chỉ tiêu theo dõi 46 2.5.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 47 - 47 2.6.1. Mô tả nội dung: 47 2.6.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 47 2.6.3. Các chỉ tiêu theo dõi 47 2.6.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 47 β-CD 48 2.7.1. Mô tả nội dung: 48 2.7.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 48 48 2.7.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 48 2.8. Độc tính cấp của β–CD 48 2.8.1. Mô tả nội dung: 48 2.8.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 49 2.8.3. Các chỉ tiêu theo dõi 50 2.8.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 50 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 51 3.1. Cố định CGTase trên một số giá mang rắn 51 3.1.1. Xây dựng đƣờng chuẩn protein 51 3 3.0L 51 3.1.3. Cố định trên Al 2 O 3 52 3.1.4. Cố định trên Q-Sepharose 53 3.1.5. Cố định trên Purolite A100 55 3.1.6. Cố định trên Chitosan 57 3.1.7. Cố định trên Eupergit C 59 vii 3.1.8. Cố định trên Alginat 61 nghiên cứu 63 β-CD 65 65 3.2.2. Khảo sát lƣợng dung môi sử dụng 66 3.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của pH 67 3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ: 67 3.3. Tối ƣu hóa quy trình tạo β-cyclodextrin 68 β- 68 β- 70 3.4. Xây dựng quy trình thu hồi enzym và dung môi 75 3.4.1. Quy trình thu hồi enzym 75 3.4.2. Quy trình thu hồi dung môi 79 3.5. Xây dựng quy trình tinh chế sản phẩm β-cyclodextrin 81 3.5.1. Nghiên cứu làm sạch sơ bộ cyclodextrin bằng than hoạt tính 81 β-CD 82 - 83 3.7. Tiêu 86 β-CD 87 β-CD 90 91 3.8. Độc tính cấp của β-CD 91 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 95 4.1. Kết luận 95 4.2. Đề nghị 96 viii VIẾT TẮT BSA : Bovine Serum Albumine CD : Cyclodextrin α-CD : α-Cyclodextrin β-CD : β-Cyclodextrin γ-CD : γ-Cyclodextrin CGTase : Cyclodextrin glucanotransferase 2,3-DHP-β-CD : 2,3-dihydroxypropyl-β-Cyclodextrin 2-HE-β-CD : 2-hydroxyethyl-β-Cyclodextrin 2-HP-β-CD : 2-hydroxypropyl-β- Cyclodextrin 3-HE-β-CD : 3-hydroxypropyl-β- Cyclodextrin Ac-β-CD : β- Cyclodextrin đƣợc acetyl hóa ngẫu nhiên CME-β-CD : O-carboxymethyl-O-ethyl-β- Cyclodextrin DE-β-CD : 2,6-di-O-ethyl-β-Cyclodextrin DMA-β-CD : Per-2,6-di-O-methyl-β-Cyclodextrin DM-β-CD : 2,6-di-O-methyl-β-Cyclodextrin G 1 -β-CD : Glycosyl-β-Cyclodextrin G 2 -β-CD : Maltosyl-β-Cyclodextrin GUG-β-CD : Glucuronyl-glucosyl-β-Cyclodextrin Me-β-CD : β-Cyclodextrin đƣợc methyl hóa ngẫu nhiên SBE4-β-CD: : β-Cyclodextrin sulfobutylet, thế mức độ 4 SBE7-β-CD : β-Cyclodextrin sulfobutylet, thế mức độ 7 TA-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-acyl-β-Cyclodextrin TB-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-butanoyl-β- Cyclodextrin TE-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-ethyl-β-Cyclodextrin TM-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-methyl-β-Cyclodextrin TO-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-octyl-β-Cyclodextrin TV-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-valeryl-β-Cyclodextrin kl/ tt : tt/ tt : kl/ kl : rpm : round per minute ix DANH MỤC HÌNH 1891. 2 Hình 1.2. Sự tƣơng quan giữa giá và sản lƣợng của β-CD 3 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của α-, β-, γ- cyclodextrin 3 β-Cyclodextrin. 4 Hình 1.5. 8 Hình 1.6. Sự thủy phân tinh bột bởi CGTase tạo cyclodextrin 13 Hình 1.7. β-CD sau khi thu nhận và kết tinh 24 Hình 2.1. Quy trình cố định CGTase trên Al 2 O 3 30 Hình 2.2. Quy trình cố định CG Tase lên Q-Sepharose 31 Hình 2.3. Quy trình cố định CGTase trên Purolite A100 31 Hình 2.4. Quy trình cố định CGTase trên chitosan 34 Hình 2.5. Quy trình cố định CGTase trên alginat 36 -Behnken 40 Hình 3.1. . 51 Hình 3.2. β-CD. 52 - ) CGTase 54 Hình 3.4. Chitosa ) CGTase 58 ) CGTase 60 Hìn 62 Hình 3.7. Hiệu suất chuyển đổi β-CD từ các loại tinh bột 65 Hình 3.8. 66 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sản xuất β-CD 67 β-CD 69 - 72 Hình 3.12. Tƣơng tá β- CD 73 Hình 3.13. Hiệu suất chuyển đổi β-CD từ tinh bột với enzym tự do và cố định 76 Hình 3.14. Hiệu suất sản xuất β- 78 - 84 - 3L 86 Hình 3.17. Hình ảnh nội tạng chuột 93 x DANH MỤC BẢNG . 5 . 5 Bảng 1.3. Các CD thƣờng sử dụng trong bào chế 6 Bảng 1.4. Dƣợc động học, độc tính cấp của các CD trên chuột 10 Bảng 1.5. Một số CD đƣợc dùng tăng độ ổn định của hoạt chất 10 Bảng 1.6. Một số CD cải thiện độ tan và độ hòa tan 11 13 Bảng 1.8. Tỉ lệ % kết tủa của các CD với dung môi 16 Bảng 2.1. Giai mẫu protein cho đƣờng chuẩn 26 Bảng 2.2. Giai mẫu xây dựng đƣờng chuẩn. 27 Bảng 2.3. Cách pha mẫu để xác định hoạt tính enzym 27 Bảng 2.4. Thiết kế thí nghiệm đáp ứng bề mặt (RSM) từ phần mềm DX V7.1 40 Bảng 2.5. Liều thử nghiệm LD 50 50 51 Bảng 3.2. Nồng độ ẩm enzym ban đầu 51 β-CD. 52 Bảng 3.4. 52 Bảng 3.5. Hiệu suất protein cố định theo pH 52 -Sepharose 53 trên Q-Sepharose 54 Bảng 3.8. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên Q-Sepharose 54 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pH lên quá trình cố định CGTase trên Purolite 55 Bảng 3.10. 55 Bảng 3.11. Ảnh hƣ 56 Bảng 3.12. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên Purolite A100 56 57 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của pH cố định enzym CGTase trên chitosan 57 58 Bảng 3.16. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên chitosan 58 59 Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của pH cố định enzym CGTase trên Eupergit C 59 60 Bảng 3.20. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên Eupergit C 61 2 61 62 63 Bảng 3.24. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên alginat 63 [...]... tiêu tổng quát: Xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> tạo < /b> β -cyclodextrin ở quy < /b> mô pilot Mục tiêu cụ thể: - Xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> cố định enzym CGTase - Xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> tạo < /b> β-CD với enzym tự do - Xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> tạo < /b> β-CD với enzym cố định Nội dung: - Cố định cyclomaltodextrin glucanotransferase trên giá mang rắn - Thăm dò các thông số của phản ứng tạo < /b> β-CD - Tối ƣu hóa quy < /b> trình < /b> tạo < /b> β-CD - Xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> tách và... phân tinh b t R R Tạo < /b> vòng B t đối Kết đôi R R R Cắt Hình 1.6 Sự thủy phân tinh b t b i CGTase tạo < /b> cyclodextrin 1.1.7 trong chi Bacillus nhƣ B macerans, B CGTase megaterium, B coagulans, B cereus, B circulans…) Ngoài ra enzym còn đƣợc tạo < /b> ra từ Klebsiella (K pneumoniae, K oxytoca), Thermoanaerobacterium, Micrococcus (M lutens, M varians), Anaerobranca gottschalkii … [6, 37, 50] B ng 1.7 Chủng tạo < /b> CGTase... nghiên cứu Xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> sản xuất β -cyclodextrin b ng phƣơng pháp enzym” nhằm khảo sát một số chất mang sử dụng để cố định enzym, nghiên cứu xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> sản xuất và xác định các thông số tối ƣu cho quá trình < /b> sản xuất để thu đƣợc sản phẩm β -cyclodextrin đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng 1 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cyclodextrin và sản xuất cyclodextrin 1.1.1 Lịch sử phát triển cyclodextrin. .. tách và tinh chế sản phẩm - Xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> thu hồi dung môi - Xây < /b> dựng < /b> quy < /b> trình < /b> tạo < /b> β-CD thành phẩm - Xây < /b> dựng < /b> tiêu chuẩn và phƣơng pháp kiểm định sản phẩm - Thử nghiệm độc tính cấp xii Những nội dung thực hiện (đối chiếu với hợp đồng đã ký) Cố định CGTase trên giá mang rắn - Xác định các thông số cần tối ƣu - Cố định CGTase trên Alginat, Purolite A100, hóa cho qui trình < /b> cố định CGTase: Chitosan... xi MỞ ĐẦU Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY < /b> TRÌNH TẠO β CYCLODEXTRIN B NG PHƢƠNG PHÁP ENZYM Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trần Cát Đông Cơ quan chủ trì: Trung tâm Khoa Học Công nghệ Dƣợc Sài Gòn Thời gian thực hiện đề tài: 12/2010 đến 10/2012 Kinh phí đƣợc duyệt: 550 triệu đồng Kinh phí đã cấp: 1:300 triệu đồng theo TB số: 226/TB-SKHCN ngày 26/11/2010 2: 195.000.000 đồng Theo TB số: 61 /TB-SKHCN ngày 11/06/2012... 64 B ng 3.26 Kết quả sản xuất β-CD từ các loại tinh b t 65 β 66 B ng 3.28 Ảnh hƣởng của pH đến quá trình < /b> sản xuất β-CD 67 B ng 3.29 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình < /b> sản xuất β-CD 67 B n β 68 B ng 3.31 Kết quả đánh giá độ tƣơng thích của mô hình 70 B ng 70 B ng 3.33 ịch tinh b 71 B ủa dịch tinh b 71 72 74 74 75... Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1 1.1.8 : Bacillus α- α- ) Acid a 2 α2 αα- α- - - [6, 37, 47] 1.1.9 Sản xuất CD CD đƣợc sản xuất b ng cách phân giải tinh b t với CGTase ở 30-90oC Trong công nghiệp ngƣời ta thƣờng sử dụng tinh b t b p và tinh b t khoai tây, tinh b t sắn… để sản xuất CD Các b ớc chính trong quá trình < /b> sản xuất CD nhƣ sau: 14 - Thủy phân tinh b t trƣớc với amylase - Cho tinh b t phản... E coli không có Salmonella và E coli Thử nghiệm độc tính cấp B o cáo độc tính cấp B i b o β-CD > 10000 mg/kg 2 B i b o xiv Sản phẩm của đề tài TT 1 Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học, kinh tế B o cáo khoa học về kết quả nghiên cứu CD, Tài liệu 2 Qui trình < /b> cố định CGTase Sơ đồ quy < /b> trình,< /b> các thông số công nghệ của từng công đoạn, năng suất quy < /b> trình < /b> (>100 g), hiệu suất cố định protein ( 50%), hiệu suất thu... β -cyclodextrin cao nhất :43,97% Tối ƣu hóa qui trình < /b> tạo < /b> β- 15 Xác định các thông số: nồng độ tinh - =15: 26% b t, tỷ lệ cơ chất-enzym và thời gian - Enzym CGTase: 2,91 KU/L phản ứng để cho hiệu suất chuyển - Thời gian phản ứng: 61giờ hóa β -cyclodextrin cao nhất - : 51% Xây < /b> dựng < /b> qui trình < /b> tách và tinh chế sản phẩm β-CD Sản phẩm β -cyclodextrin tinh chế đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng xiii β- > 98% Xây < /b> dựng.< /b> .. hóa biến đổi thành dạng ống, tạo < /b> ra các vật liệu b n dẫn, các hạt có giá thành rẻ hơn và độ b n cao hơn Chế tạo < /b> kiểm soát đƣợc kích thƣớc, hình dạng và cấu trúc b n trong dựa trên vật liệu ban đầu là các CD sẽ góp phần tạo < /b> nên hạt vật liệu tiên tiến ứng dụng trong các thiết b điện, các chất xúc tác, hệ thống phân phối thuốc phức tạp, vật liệu cảm quang, thanh từ tính nano…[15, 37, 48] 1.1.6 CGTase Cyclodextrin . phản ứng tạo β-CD - Tối ƣu hóa quy trình tạo β-CD - Xây dựng quy trình tách và tinh chế sản phẩm - Xây dựng quy trình thu hồi dung môi - Xây dựng quy trình tạo β-CD thành phẩm - Xây dựng tiêu. hóa quy trình tạo β -cyclodextrin 68 β- 68 β- 70 3.4. Xây dựng quy trình thu hồi enzym và dung môi 75 3.4.1. Quy trình thu hồi enzym 75 3.4.2. Quy trình thu hồi dung môi 79 3.5. Xây dựng quy. β -cyclodextrin ở quy mô pilot. Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng quy trình cố định enzym CGTase - Xây dựng quy trình tạo β-CD với enzym tự do - Xây dựng quy trình tạo β-CD với enzym cố định Nội dung: -