xây dựng quy trình để kiểm nghiệm enterobacter sakazaki trong sữa bột bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (pcr)

ii BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Xây dựng qui trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) Chủ nhiệm đề tài: TS. Vũ Thị Lâm An Cơ quan chủ trì: Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện đề tài: từ 5/2011 tới 7/2013 Kinh phí được duyệt: 300 triệu đồng Kinh phí đã cấp: 200 triệu theo TB số: 28/TB-SKHCN ngày 5/5/2011 70 triệu theo TB số: 151/TB-SKHCN ngày 22/11/2012 Mục tiêu: Xây dựng qui trình phát hiện E. sakazakii trong sữa bột bằng kỹ thuật PCR Nội dung: 1. Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E. sakazakii bằng PCR 1.1. Kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của Enterobacter sakazakii, với 2 cặp mồi để nhân bản 2 gen ompA (outer membrane protein A) và MMS (macromolecular synthesis) 1.2. Khảo sát các điều kiện phản ứng: nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl 2 , hàm lượng mồi 1.3. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi 1.4. Khảo sát độ nhạy của phương pháp PCR và thời gian tăng sinh cần thiết 1.5. PCR sử dụng chứng nội chung mồi ESSF và ESSR 1.6. Giải trình tự sản phẩm PCR 1.7. Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR 2. Đánh giá hiệu lực sơ cấp qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii bằng PCR dựa vào nhân bản gen (tên gen đã chọn từ 2 qui trình PCR kể trên) 2.1. Xác định giới hạn phát hiện Enterobacter sakazakii trong mẫu sữa bột iii 2.2. Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy 2.3. Thử nghiệm qui trình ở hai phòng thí nghiệm độc lập 3. Kết quả của đề tài - Qui trình PCR1 để nhân bản gen ompA là qui trình được chọn để kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR. Điều kiện tối ưu tiến hành qui trình PCR này bao gồm: nồng độ mồi 10 pm, nhiệt độ bắt cặp 57 o C và nồng độ MgCl 2 3 mM. Thời gian tăng sinh cần thiết đối với mẫu sữa bột là 24 giờ trong nước peptone (BPW) ủ ở nhiệt độ 37 o C. Với thời gian tăng sinh 24 giờ, qui trình PCR1 có thể phát hiện E. sakazakii ngay cả ở mức 1 CFU/25g mẫu sữa bột. Việc sử dụng chứng nội chung mồi và UNG trong quá trình thực hiện PCR không làm ảnh hưởng tới kết quả của kiểm nghiệm mà còn cho phép loại trừ kết quả âm và dương tính giả. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đã khẳng định có sự tương đồng rất cao của đoạn gen đích với đa số chủng E. sakazakii trong ngân hàng gen. - Giới hạn phát hiện (LOD) của qui trình PCR đề xuất là 1 CFU/25 g sữa bột. Các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR đề xuất đã đảm bảo các chuẩn mực thẩm định một phương pháp thay thế với: Độ chính xác (AC) 95%, Độ đặc hiệu (SP) 100%, Độ nhạy (SE) 90%, Độ lệch dương (PD) 0%, Độ lệch âm (ND) 10%. 4. Sản phẩm của đề tài: Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR và một bài báo đăng trên Tạp Chí Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp. iv Project title: Development of an Enterobacter sakazakii detection procedure in milk powder using polymerase chain reaction (PCR) Executive institution: the University of Agriculture and Forestry, Ho Chi Minh City (or Nong Lam University) Duration: from May 2011 to July 2013 Objective: to develop Enterobacter sakazakii detection procedure in milk powder using PCR technique. Research contents: 1. Development of E. sakazakii detection procedure in milk powder using PCR 1.1 Examination of amplification of E. sakazakii genes using two pairs of primers that amplify gene fragments of ompA gene (outer membrane protein A) as PCR 1 and MMS gene (macromolecular synthesis) as PCR 2 1.2 Investigation of PCR conditions of the chosen PCR: annealing temperature, concentration of MgCl 2 and primers. 1.3 Examination of specificity of the primers 1.4 Examination of sensitivity of the chosen PCR and the enrichment time 1.5 PCR using exogenous positive control EPC with primers ESSF và ESSR 1.6 Sequencing of PCR products 1.7 PCR procedure for detection of E. sakazakii in powdered milk 2. Primary validation of the achieved procedure using PCR for detection of E. sakazakii in powdered milk 2.1 Determination of detection limit (LOD) of the PCR for detection of E. sakazakii in powdered milk 2.2 Comparative study on: relative accuracy, specificity and sensitivity and positive and negative deviation between PCR and conventional method 2.3 Assessment of PCR procedure at two officially approved laboratories 3. Research results v - The PCR 1, the ompA-targeted one, was chosen for detection of E. sakazakii in powdered milk. Optimal conditions for the chosen PCR were: the concentration of primer of 10 pm, anealing temperature of 57 o C and concentration of MgCl 2 of 3 mM. Enrichment time was 24 h in buffered peptone water at 37 o C. After 24 h of enrichment, the PCR could detect E. sakazakii at level of 1 CFU/25 g. The presence of the EPC with the adjusted amount of EPC and the UNG did not affect the target sensitivity, but did avoid PCR false negative and false positive results. Comparison of the nucleotide sequences of the PCR products with other sequences available in the GenBank database revealed a high degree of homology with ompA genes of other strains of E. sakazakii. - The limit of detection (LOD) of the PCR method was 1 CFU/25 g. The technical parameters of PCR method were calculated: relative accuracy (AC) 95%, relative specificity (SP) 100%, relative sensitivity (SE) 90%, positive deviation (PD) 0% and negative deviation (ND) 10%. 4 Research products: PCR procedure for detection of E. sakazakii in powdered milk and an article on the Journal of Agricultural Sciences and Technology. vi MỤC LỤC Trang Danh sách thành viên tham gia và Lời cảm ơn i Tóm tắt báo cáo (gồm tiếng Việt và tiếng Anh) ii Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách hình xi Bảng quyết toán giám định giai đoạn 1 xii Bảng quyết toán kinh phí giai đoạn 2 xiii Phần mở đầu 1 Chương I: Tổng quan 1.1 Giới thiệu sơ lược về Enterobacter sakazakii và các phương pháp xác định vi khuẩn này trong thực phẩm 1.2 Một số nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài 1.3 Ý nghĩa khoa học 4 4 11 11 Chương II: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E. sakazakii bằng PCR 2.1.1 Kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của E. sakazakii 2.1.2 Khảo sát các điều kiện phản ứng: nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl 2 , hàm lượng mồi 2.1.3 Kiểm tra tính đặc biệu của các cặp mồi 13 13 13 14 15 vii 2.1.4 Khảo sát độ nhạy của phương pháp PCR và thời gian tăng sinh cần thiết 2.1.5 PCR sử dụng chứng nội chung mồi ESSF và ESSR 2.1.6 Giải trình tự sản phẩm PCR 2.1.7 Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR 2.2 Đánh giá hiệu lực sơ cấp Enterobacter sakazakii bằng PCR dựa vào nhân bản gen 2.2.1 Xác định giới hạn phát hiện Enterobacter sakazakii trong mẫu sữa bột bằng PCR so với phương pháp truyền thống 2.2.2 Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy 2.2.3 Thử nghiệm qui trình ở hai phòng thí nghiệm độc lập 16 17 19 19 20 20 21 22 Chương III: Kết quả và thảo luận 3.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E. sakazakii bằng PCR 3.1.1 Chọn lựa qui trình PCR 3.1.2 Khảo sát các điều kiện phản ứng: nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl 2 , hàm lượng mồi 3.1.2.1 Tối ưu hàm lượng mồi 3.1.2.2 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 3.1.2.3 Khảo sát nồng độ MgCl 2 3.1.3. Kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình PCR 3.1.4. Khảo sát độ nhạy của phương pháp PCR và thời gian tăng sinh cần thiết 3.1.4.1 Kết quả khảo sát sau thời gian tăng sinh 8 giờ 3.1.4.2 Kết quả khảo sát sau thời gian tăng sinh 24 giờ 3.1.5 Kết quả sử dụng chứng nội chung mồi ESSF và ESSR 23 23 23 24 24 25 26 27 29 29 30 31 viii 3.1.6 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR 3.1.7 Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR 3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu lực sơ cấp Enterobacter sakazakii bằng PCR dựa vào nhân bản gen 3.2.1 Xác định giới hạn phát hiện Enterobacter sakazakii trong mẫu sữa bột bằng PCR so với phương pháp truyền thống 3.2.2 Kết quả khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy 3.2.3 Kết quả thử nghiệm qui trình ở hai phòng thí nghiệm độc lập 3.3 Qui trình đề xuất 32 32 33 33 34 36 37 Chương IV: Kết luận và đề nghị 43 Tài liệu tham khảo 44 Phụ lục 50 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT ATCC American Type Culture Collection bp Base pair BPW Môi trường Buffered peptone water CFU Colony forming unit DNA Deoxyribonucleic acid DW Distilled water, nước cất ĐC Đối chứng FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA Food and Drug Administration h Giờ LOD Limit of detection min Phút µM Micromole NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction WHO World Health Organization x DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG TRANG 2.1 Primer và trình tự các nucleotide của primer 13 2.2 Điều kiện thực hiện PCR 14 2.3 Chu trình nhiệt cho PCR 18 3.1 Kết quả kiểm nghiệm E. sakazakii bằng phương pháp PCR và nuôi cấy 34 3.2 Kết quả kiểm nghiệm E. sakazakii trong các mẫu sữa bột và bột sữa tập ăn 35 3.3 So sánh các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR và nuôi cấy truyền thống 36 3.4 Kết quả kiểm nghiệm các mẫu sữa bột ở hai phòng thí nghiệm độc lập 37 xi DANH SÁCH HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1 Quy trình phân lập E. sakazakii theo CLF, FDA, ISO 7 1.2 Khuẩn lạc của E. sakazakii trên ESPM, DFI và OK 9 3.1 Hình ảnh sản phẩm PCR trên bản điện di của PCR1 và PCR2 23 3.2 Hình ảnh sản phẩm PCR trên bản điện di khi thay đổi hàm lượng mồi 24 3.3 Hình ảnh sản phẩm PCR trên bản điện di khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp 25 3.4 Hình ảnh sản phẩm PCR trên bản điện di khi thay đổi nồng độ MgCl 2 26 3.5 Sản phẩm PCR trên bản điện di- mẫu sữa bột gây nhiễm với E. sakazakii 27 3.6 Hình ảnh sản phẩm PCR trên bản điện di- mẫu sữa bột gây nhiễm vi khuẩn khác 28 3.7 Sản phẩm PCR trên bản điện di- sữa bột gây nhiễm E. sakazakii và tăng sinh 8 h 29 3.8 Sản phẩm PCR trên bản điện di- sữa bột gây nhiễm E. sakazakii và tăng sinh 24 h 30 3.9 Sản phẩm PCR trên bản điện di – Có và không sử dụng chứng nội chung mồi 31 3.10 Sản phẩm PCR trên bản điện di có sử dụng chứng nội chung mồi với DNA được pha loãng 32 3.11 Tóm tắt qui trình PCR 33 [...]... Hồ Chí Minh”, 2/22 mẫu sữa bột trẻ em được phát hiện có E sakazakii nhờ phương pháp FDA (Dương Ngọc Phương và Vũ Thị Lâm An, 2008) - Kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột trẻ em theo phương pháp ISO/TS 22964” đã phát hiện E sakazakii trong 7 mẫu sữa trên tổng số 40 mẫu (Trần Thị Mộng Dung, Vũ Thị Lâm An và Võ Minh Châu, 2009) - Kiểm nghiệm E sakazakii trong sữa bột trẻ em theo phương pháp... quả giải trình tự sau đó sẽ được tra cứu (NCBI blast search) để so sánh với ngân hàng gene và đánh giá sự tương đồng về kiểu gen của sản phẩm PCR thu được với các chủng E sakazakii chuẩn trong ngân hàng gen 2.1.7 Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR - Trích 25 g mẫu sữa bột từ mẫu cần kiểm nghiệm, bên cạnh đó trích 75 g mẫu lưu (mẫu này được trữ lạnh ở -20 oC để kiểm tra... cấp Enterobacter sakazakii bằng PCR dựa vào nhân bản gen 2.2.1 Xác định giới hạn phát hiện Enterobacter sakazakii trong mẫu sữa bột bằng PCR so với phương pháp truyền thống Mục đích: Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp PCR so với phương pháp truyền thống Tiến hành: - Chọn 1 loại sữa bột, khử trùng bằng phương pháp chiếu xạ để có mẫu sữa bột vô trùng Các mẫu sữa này được kiểm tra bằng PCR để. .. 1.2 Một số nghiên cứu trong nước liên quan tới đề tài Chủ nhiệm đề tài đã chủ trì hướng dẫn các nghiên cứu xác định E sakazakii trong sữa bột: - Kiểm nghiệm E sakazakii trong sữa bột dành cho trẻ em”, tiến hành theo phương pháp ISO/TS 22964, đã phát hiện trong E sakazakii 7/20 mẫu sữa (Trần Thị Viết Hiếu và Vũ Thị Lâm An, 2008) - “Phát hiện vi khuẩn Enterobacter sakazakii từ sữa bột tại thành phố Hồ... phẩm bột trẻ em từ 2 sữa đã và đang chiếm lĩnh thị phần rất lớn trên thị trường Trong khi kết quả kiểm nghiệm các mẫu sữa bột theo các phương pháp truyền thống do chúng tôi thực hiện trước đây cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn này trong các mẫu sữa bột được kiểm Một số qui trình kiểm nghiệm E sakazakii truyền thống đã được công nhận trên thế giới và đang được áp dụng, nhưng thời gian kiểm nghiệm. .. thống Vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng qui trình kiểm nghiệm E sakazakii trong sữa bột và thực phẩm bột từ sữa có thời gian thực hiện ngắn và chi phí thấp, phù hợp điều kiện và yêu cầu tại Việt Nam là rất cần thiết 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lược về Enterobacter sakazakii và các phương pháp xác định vi khuẩn này trong thực phẩm Enterobacter sakazakii (E sakazakii) là vi khuẩn gram... 1: Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E sakazakii bằng PCR 2.1.1 Kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của E sakazakii Mục đích: kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của E sakazakii Vật liệu: chủng gốc Enterobacter sakazakii ATCC 4869 từ microbank (Pro-Lab Diagnostics, Mỹ) được cấy trên môi trường thạch máu, ủ ở 37 °C trong 24 giờ Khuẩn lạc được thu bằng que cấy và pha vào nước tinh khiết (không có DNA) để. .. hiện qui trình PCR Lặp lại 3 lần cho mỗi độ pha loãng - Đánh giá độ nhạy của qui trình, thời gian tăng sinh cần thiết (tối ưu) Kết quả cần đạt được: đánh giá khả năng phát hiện E sakazakii trong các mẫu sữa bột của qui trình PCR, thời gian tăng sinh mẫu thích hợp và các mức mật độ của vi khuẩn mà qui trình có thể phát hiện được Từ đó đưa ra 1 qui trình kiểm nghiệm E sakazakii trong sữa bột bằng PCR... 2001) Sự lây nhiễm E sakazakii thường liên quan tới các sản phẩm sữa bột và bột trẻ em từ sữa ngay cả sản phẩm sau hai năm được bảo quản vì sữa bột không được khử trùng trong giai đoạn cuối của quá trình chế biến nên khả năng có vi trùng trong hộp và túi đựng rất cao mà nhiệt độ của nước pha chế sữa bột cho trẻ sử dụng nằm trong khoảng điều kiện phát triển tốt cho Enterobacter sakazakii 1 Đặc biệt... hướng sử dụng rộng rãi kỹ thuật PCR trong kiểm nghiệm E sakazakii 11 Kết quả của nghiên cứu sẽ mở ra một hướng đi mới trong việc áp dụng kỹ thuật PCR trong thực tế kiểm nghiệm tại các đơn vị kiểm nghiệm thực phẩm cũng như tại các công ty chế biến thực phẩm 12 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài đã được tiến hành từ 5/2011 tới 7/2013 tại Trung Tâm Chẩn Đoán Xét Nghiệm Bệnh Động Vật, . tiêu: Xây dựng qui trình phát hiện E. sakazakii trong sữa bột bằng kỹ thuật PCR Nội dung: 1. Xây dựng qui trình kiểm nghiệm E. sakazakii bằng PCR 1.1. Kiểm tra khả năng nhân bản sao gen của Enterobacter. ii BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Xây dựng qui trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) Chủ nhiệm đề tài: TS. Vũ. tự sản phẩm PCR 1.7. Qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii trong sữa bột bằng PCR 2. Đánh giá hiệu lực sơ cấp qui trình kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii bằng PCR dựa vào nhân bản