KIỂM NGHIỆM Enterobacter sakazakii TRONG SỮA BỘT TRẺ EM THEO PHƯƠNG PHÁP ISOTS 22964

KIỂM NGHIỆM Enterobacter sakazakii TRONG SỮA BỘT TRẺ EM THEO PHƯƠNG PHÁP ISO/TS 22964 Tác giả TRẦN THỊ MỘNG DUNG Khố luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Kỹ sư ngành Chế Biến Bảo Quản Nông Sản Thực Phẩm Giáo viên hướng dẫn TS VŨ THỊ LÂM AN ThS VÕ MINH CHÂU Tháng năm 2009 i LỜI CẢM ƠN Con thành kính biết ơn công lao to lớn cha mẹ sinh thành ni dưỡng để có ngày hơm Chân thành khắc ghi công ơn dạy dỗ thầy cô trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt thầy khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm tận tình truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt trình học tập trường Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến cô Vũ Thị Lâm An, giảng viên khoa Công Nghệ Thực Phẩm, người trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn anh Võ Minh Châu tất anh chị Cơ Quan Thú Y vùng VI - 124 Phạm Thế Hiển, phường 2, quận 8, thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tận tình tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài Sau cùng, xin cảm ơn tất bạn bè gắn bó, động viên chia sẻ khó khăn suốt thời gian qua Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng năm 2009 Sinh viên thực Trần Thị Mộng Dung ii TÓM TẮT Enterobacter sakazakii (E sakazakii) loại vi khuẩn gặp, nhiễm vào thể tỷ lệ tử vong cao từ 40 ÷ 80 % thông qua nguồn thực phẩm, đặc biệt sữa bột dành cho trẻ em Mức độ nguy hiểm E sakazakii sữa bột nghiêm trọng, gây bệnh viêm màng não, viêm ruột non nhiễm trùng máu Do đó, để xác định mức độ nhiễm vi khuẩn sữa bột, tiến hành đề tài: “Kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii sữa bột trẻ em theo phương pháp ISO/TS 22964” Đề tài thực phòng vi sinh Cơ Quan Thú Y vùng VI - 124 Phạm Thế Hiển, phường 2, quận 8, thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ 09/03/2009 đến 31/05/2009 Chúng tiến hành kiểm nghiệm E sakazakii 40 mẫu sữa bột dành cho trẻ em theo phương pháp ISO/TS 22964 Các mẫu sữa thu thập từ chợ, siêu thị phố sữa Nguyễn Thơng… Hầu hết mẫu sữa có nhãn hiệu có mẫu sữa bột cân ký không rõ nguồn gốc E sakazakii phát từ mẫu sữa bột đối chiếu với chủng gốc ATCC 4869 Đồng thời so sánh kết kiểm nghiệm E sakazakii sữa bột trẻ em với kết kiểm nghiệm tác giả nước ngồi nước Sau tiến hành thí nghiệm, chúng tơi phát mẫu có diện E sakazakii tổng số 40 mẫu sữa bột kiểm nghiệm, với tỷ lệ nhiễm 17,5% Kết kiểm nghiệm tái khẳng định sữa bột nguồn lây nhiễm bệnh E sakazakii Đồng thời lời cảnh báo quan chức việc kiểm nghiệm vi khuẩn sữa bột iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thực trạng nhiễm bệnh E sakazakii 2.2 Nguồn xâm nhiễm E sakazakii 2.2.1 Từ thực phẩm 2.2.2 Từ môi trường 2.3 Các đặc tính E sakazakii 2.3.1 Phân loại khoa học E sakazakii 2.3.2 Đặc điểm hình thái 2.3.3 Đặc điểm sinh lý 2.3.4 Đặc điểm sinh hố 11 2.4 Triệu chứng, cách phòng ngừa cách điều trị bệnh nhiễm E sakazakii 13 2.4.1 Triệu chứng bệnh 13 2.4.2 Cách phòng ngừa 13 2.4.3 Cách điều trị 14 2.5 Phương pháp phát E sakazakii 14 2.5.1 Phương pháp truyền thống 14 iv 2.5.2 Phương pháp phân lập mơi trường có chất phát quang 16 2.5.3 Phương pháp sinh học phân tử 17 2.5.3.1 Polymerase Chain Reaction 18 2.5.3.2 Random amplified of polymorphic DNA 18 2.5.3.3 Pulsed - field gel electrophoresis 18 2.5.3.4 Flourescence in situ hybridization 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Địa điểm nghiên cứu bố trí thời gian 20 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 20 3.1.2 Bố trí thời gian 20 3.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.2.1 Mẫu kiểm nghiệm chủng gốc E sakazakii 20 3.2.2 Môi trường hoá chất 20 3.3 Dụng cụ thiết bị 21 3.3.1 Dụng cụ 21 3.3.2 Thiết bị 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Quy trình phân lập 22 3.4.1.1 Tiền tăng sinh 24 3.4.1.2 Tăng sinh chọn lọc 24 3.4.1.3 Phân lập 24 3.4.1.4 Nhuộm Gram thử phản ứng sinh hoá 24 3.4.1.4.1 Khả lên men loại đường 24 3.4.1.4.2 Kit sinh hoá IDS 14GNR 24 3.4.1.5 Theo dõi đánh giá kết 24 3.4.2 Đối chiếu E sakazakii phân lập từ mẫu sữa với chủng gốc E sakazakii 26 3.4.3 Các tiêu quan sát 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết kiểm nghiệm E sakazakii sữa bột theo phương pháp v ISO/TS 22964, so sánh E sakazakii phân lập với chủng gốc 27 4.2 So sánh kết kiểm nghiệm E sakazakii 40 mẫu sữa bột theo phương pháp ISO/TS 22964 với kết kiểm nghiệm tác giả nước nước 35 4.2.1 So sánh với kết kiểm ngiệm tác giả nước 35 4.2.2 So sánh với kết kiểm nghiệm tác giả nước 36 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị 38 5.2.1 Về phương pháp kiểm nghiệm 38 5.2.2 Về phía người sản xuất 38 5.2.3 Về phía quan chức 39 5.3.4 Về phía người tiêu dùng 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 46 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT α-MUG 4-methylumbelliferyl-alpha-D-glucoside API Analytical Profile Index BPW Buffered Peptone Water CDC Centers for Disease Control and Prevention CLF Central Laboratories Friedrichdorf ctv cộng tác viên cfu colony forming unit DFI Druggan Forsythe Iversen Agar DNA Deoxyribonucleic acid E sakazakii Enterobacter sakazakii EE Enterobacteriaceae Enrichment Broth ESPM Enterobacter sakazakii Plating Medium FAO Food and Agriculture Organization FDA Food and Drug Adminstration FSAI Food Safety Authority of Ireland ICMSF International Commission for Microbiological Specification for Foods ISO International Standard Organization mLST modified Lauryl Sulfate Tryptone NA Nutrient Agar PE Polyethylene VIT vermicon identification technology rARN ribosom ribonucleic acid TS Technical standard TSA Tryptic Soy Agar UV Ultraviolet VRBGA Violet Red Bile Glucose Agar WHO World Health Organization vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Một vài trường hợp bùng phát bệnh nhiễm E sakazakii Bảng 2.2 Giá trị D giá trị z E sakazakii sữa bột dành cho trẻ em 11 Bảng 2.3 Một số khác biệt sinh hoá E sakazakii với loài khác 12 Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hố E sakazakii 13 Bảng 3.1 Các mơi trường sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng kiểm nghiệm 22 Bảng 3.3 Khả sử dụng loại đường vi khuẩn E sakazakii 25 Bảng 3.4 Kết phản ứng sinh hoá kit IDS 14GNR E sakazakii 25 Bảng 4.1 Kết khả lên men loại đường 12 mẫu sữa bột 31 Bảng 4.2 Kết thử phản ứng sinh hoá kit IDS 14GNR mẫu sữa bột cho kết sorbitol dương tính 33 Bảng 4.3: Kết thử phản ứng sinh hoá kit IDS 14GNR mẫu sữa bột cho kết sorbitol âm tính 34 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ nguyên nhân nhiễm E sakazakii vào trẻ em gây bệnh thơng qua q trình chuẩn bị sữa bột Hình 2.2 Vi khuẩn E sakazakii Hình 2.3 Giới hạn nhiệt độ phát triển E sakazakii Hình 2.4 Quy trình phân lập E sakazakii theo ba phương pháp CLF, FDA, ISO 15 Hình 2.5 Khuẩn lạc E sakazakii ESPM, DFI OK 17 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình phân lập E sakazakii sữa bột phương pháp ISO/TS 22964 23 Hình 4.1 Độ đục môi trường tăng sinh chọn lọc mLST/vancomycin sau 24 ủ 44oC 27 Hình 4.2 Khuẩn lạc chủng gốc E sakazakii khuẩn lạc E sakazakii phân lập từ mẫu sữa bột môi trường TSA sau 24 ủ, 37oC 29 Hình 4.3 Chủng gốc E sakazakii vi khuẩn E sakazakii phân lập ủ TSA 37oC 30 Hình 4.4 Các mơi trường đường glucose, lactose, saccharose trước lên men sau lên men 31 Hình 4.5 Môi trường đường sorbitol trước lên men sau lên men 32 ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Tổ chức y tế giới khuyến cáo nên ni sữa mẹ hồn tồn sáu tháng đầu đời sữa mẹ nguồn dinh dưỡng tốt cho phát triển trẻ sơ sinh Có thể số nguyên nhân đó, người mẹ khơng thể tiếp tục ni nguồn sữa sữa bột nguồn dinh dưỡng khoáng chất chủ yếu cung cấp cho bé Nhưng nguồn sữa bột bị lây nhiễm vi khuẩn điều kiện vệ sinh sản xuất hay bảo quản sữa không tốt, chúng trở thành môi trường trung gian truyền mầm bệnh cho trẻ em Trong đó, E sakazakii mầm bệnh xuất vài thập niên gần đây, gây bệnh nghiêm trọng bệnh viêm màng não, nhiễm trùng máu viêm ruột non chí dẫn đến tử vong trẻ sơ sinh Tổng cục kiểm dịch, giám sát kiểm tra chất lượng Trung Quốc vừa qua phát vi khuẩn đường ruột gây chết người E sakazakii 9,6 sữa bột dành cho trẻ em Công ty thực phẩm Vị Tồn (Đài Loan) xuất qua Hồng Kơng vào cuối năm 2008 Khối lượng lớn sữa bị buộc phải tiêu huỷ Phát kịp thời quan chức giúp ngăn chặn hậu lường trước (Báo O2TV) Các nghiên cứu vi khuẩn chưa thực nước ta phổ biến nước khác giới Liệu Việt Nam sữa bột có phải nguồn lây nhiễm bệnh E sakazakii cho trẻ hay không? Để xác định mức độ nhiễm E sakazakii sữa bột, tiến hành đề tài “Kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii sữa bột trẻ em theo phương pháp ISO/TS 22964” Tiến sĩ Vũ Thị Lâm An Thạc sĩ Võ Minh Châu đồng hướng dẫn 1.2 Mục đích Kiểm nghiệm vi khuẩn E sakazakii từ nguồn sữa bột trẻ em thu thập cửa hàng bán lẻ thành phố Hồ Chí Minh (12): 3979 - 3985 10 CDC (Central for Disease Cotrol and Prevention), 2002 Enterobacter sakazakii Infections Associated with the Use of Powdered Infant Formula - Tennessee, 2001 51 (14): 298 - 300 11 Derzelle S., and Dilasser F., 2006 A robotic DNA purification protocol and realtime PCR for the detection of Enterobacter sakazakii in powdered infant formulae BioMed Central Microbiology 100 (6): 1471 - 1483 12 Drudy D., Mullane R.N., Quinn T., Wall G.P., and Fanning S., 2006 Enterobacter sakazakii: an emerging pathogen in powdered infant formula Food Safety 42: 906 - 1002 13 Drudy D., O’Rourke M., Murphy M., Mullane R.N., O’Mahony R., Kelly L., Fischer M., Sanjaq S., Shannon P., O’Mahony M., Whyte P., Fanning S., 2006 Characterization of a collection of Enterobacter sakazakii isolates from environmental and food sources International Journal of Food Microbiology 110: 127 - 134 14 Fiore A., Casale M., and Aureli P., 2008 Enterobacter sakazakii: epidemiology, clinical presentation, prevention and control Ann Ist Super Sanità 44 (3): 275 280 15 Forsythe J.S., 2005 Enterobacter sakazakii and other bacteria in powdered infant formula Maternal and Child Nutrition 1: 44 - 50 16 Gurtler J.B., Beuchat L.R., 2005 Performance of media for recovering stressed cells of Enterobacter sakazakii as determined using spiral plating and ecometric techniques Applied and Environmental Mirobiology 71 (12): 7661 - 7669 17 Hassan A.A., Akineden O., Kress C., Estuningsih S., Schneider E., and Usleber E., 2007 Characterization of 16S rRNA of Enterobacter sakazakii and development of a species-specific PCR method International Journal of Food Microbiology 116: 214 - 220 18 Hunter J.C., Petrosyan M., Ford R.H., and Prasadarao V.N., 2008 Enterobacter sakazakii: an emerging pathogen in infants and neonates National Institutes of Health Public Access Author Manuscript (5): 533 - 539 19 Iversen C., Druggan P., Schumacher S., Lehner A., Feer C., Gschwend K., Joosten H., and Stephan R., 2008 Development of a novel screening method for the isolation of “Cronobacter” spp (Enterobacter sakazakii) Applied and Environmental Microbiological 74 (8): 2550 - 2553 41 20 Iversen C., and Forsythe J.S., 2007 Comparision of media for the isolation of Enterobacter sakazakii Applied and Environmental Microbiological 73 (1): 48 - 52 21 Iversen C., and Forsythe S., 2004 Isolation of Enterobacter sakazakii and Enterobactericeae from powdered infant formula milk and related products Food Microbiology 21(6): 771 - 777 22 Iversen C., Lancashire L., Waddington M., Forsythe S., and Ball G., 2006 Identification of Enterobacter sakazakii from closely related species: the use of artifical neural networks in the analysis of biochemical and 16S rADN data BioMed Central Microbiology 28 (6): 1471 - 2180 23 Iversen C., Lane M., and Forsythe S.J, 2004 The growth profile, thermotolerance and biofilm formation of Enterobacter sakazakii grown in infant formula milk Letters in Applied Microbiology 38: 378 - 382 24 Iversen C., Lehner A., Mullane N., Marugg J., Fanning S., Stephan R., and Joosten H., 2007 Identification of “Cronobacter” spp (Enterobacter sakazakii) Journal of Clinical Microbiology 45 (11): 3814 - 3816 25 Iversen C., Waddington M., Farmer J.J., and Forsythe S., 2006 The biochemical differentiation of Enterobacter sakazakii genotypes BioMed Central Microbiology 94 (6): 1471 - 1478 26 Iversen C., Waddington M., On L.W.S., and Forsythe S., 2004 Identification and phylogeny of Enterobacter sakazakii relative to Enterobacter and Citrobacter Species Journal of Clinical Microbiology 42 (11): 5368 - 5370 27 Kandhai M.C., Reij M.W, Gorris L.G.M., Guillaime-Gentil O., and Van Schothorst M., 2004 Occurrence of Enterobacter sakazakii in food production environments and households The Lancet 363: 39 - 40 28 Kim H., Ryu J.H., and Beuchat L.R., 2007 Effectiveness of disinfectants in killing Enterobacter sakazakii in suspension, dried on surface of stainless steel, and in a biofilm Applied and Environmental Microbiology 73 (4): 1256 - 1265 29 Kim H., Ryu H.J., and Beuchat R.L., 2006 Attachment of and biofilm formation by Enterobacter sakazakii on stainless steel and enteral feeding tubes Applied and Environmental Microbiology 72 (9): 5846 - 5856 30 Kim H.S., and Park H.J., 2007 Thermal resistance and inactivation of Enterobacter sakazakii isolates during rehydration of powdered infant formular Journal of Microbiology and Biotechnology 17 (2): 364 - 368 31 Kim P.K., and Loessner J.M., 2008 Enterobacter sakazakii invasion in human 42 intestinal caco-2 cells requires the host cell cytoskeleton and is enhanced by disscruption of tight junction Infection and Immunity 76 (2): 562 - 570 32 Lehner A., Grimm M., Rattei T., Ruepp A., Frishman D., Manzardo G.G., Stephan R.,2006 Cloning and characterization of Enterobacter sakazakii pigment genes and in situ spectroscopic analysis of pigment Ferderation of European Microbiological Societies 265: 244 - 248 33 Lehner A., Nitzsche S., Breeuwer P., Diep B., Thelen K., and Stephan R., 2006 Comparison of two chromogenic media and evaluation of two molecular based identification systems for Enterobacter sakazakii detection BioMed Central Microbiology 15 (6): 1471 - 2180 34 Lehner A., Tasara T., and Stephan R., 2004 16 rARN gene based analysis of Enterobacter sakazakii strains from different sources and development of a PCR assay for identification BioMed Central Microbiology 43 (4): 1471 1480 35 Mullane R.N., Murray J., Drudy D., Prentice N., Whyte P., Wall G.P., Parton A., and Fanning S., 2006 Detection of Enterobacter sakazakii in dried infant milk formula by Cation-Magnetic-Bead capture Applied and Environmental Microbiology 72 (9): 6325 - 6330 36 Mullane R.N., Ryan M., Iversen C., Murphy M., O’ Gaora P., Quinn T., and Whyte P., 2008 Development of multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis for the molecular subtyping of Enterobacter sakazakii Applied and Environmental Microbiology 74 (4): 1223 - 1231 37 Mullane R.N., Whyte P., Wall G.P., and Fanning S., 2007 Application of pulsed field gel electrophoresis to characterise and trace the prevalence of Enterobacter sakazakii in an infant formula processing facility International Journal of Food Microbiology 116: 73 - 81 38 Murad A.A., Lin M., Hamzah M., Al-Qadiri, and Rasco B.A., 2008 A comparative study between overlay method and selective-differential media for recovery of stressed Enterobacter sakazakii cells from infant formula Food Microbiology 25: 22 - 28 39 Muytjens L.H., Zanen C.H., Sonderkamp J.H., Kollee A.L., Wachsmuth K.I., and Farmer J.J, 1983 Analysis of eight cases of neonatal meningitis and sepsis due to Enterobacter sakazakii Journal of clinical microbiology 18 (1): 115 - 120 40 Nazarowec-White M., and Farber M.J., 1997 Thermal resistance of Enterobacter sakazakii in reconstituted dried-infant formula Letters in Applied Microbiology 24: - 13 43 41 Oh S.W., and Kang D.H., 2004 Fluorogenic selective and differential medium for isolation of Enterobacter sakazakii Applied and Environmental Microbiology 70 (9): 5692 - 5694 42 Proudy I., Bougle D., Coton E., Coton M., Leclercq R., and Vergnaud M., 2008 Genotypic characterization of Enterobacter sakazakii isolates by PFGE, BOXPCR and sequencing of Flic gen The Society for Applied Microbiology 70 (9): 5692 - 5694 43 Richards G.M., Gurtler J.B., and Beuchat L.R., 2005 Survival and growth of Enterobacter sakazakii in infant rice cereal reconstituted with water, milk, liquid infant formula, or apple juice Journal of Applied Microbiology, 99: 844 - 850 44 Sanjaq S., 2007 Enterobacter sakazakii - Risikoprofil und Untersuchungen zum Nachweis in Sauglingsnahrungen Aus dem institut fur Angewandte Mikrobiologie der Justus-Liebig-Universitat Gieβen 45 Shaker R., Osaili T., Al-Omary W., Jaradat Z., and Al-Zuby M, 2007 Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacter sp from food and food production environments Food control 18: 1241 - 1245 46 Townsend S., Hurrell E., and Forsythe S., 2008 Virulence studies of Enterobacter sakazakii isolates associated with a neonatal intensive care unit outbreak BioMed Central Microbiology 64 (8): 1471 - 1480 47 Van Acker J., Smet de F., Dermans M.G., Bougatef A., Naessens A., and Lauwers S., 2001 Outbreak of necrotizing enterocolitis associated with Enterobacter sakazakii in powdered milk formula Journal Clinical Micobiology 39 (1): 293 297 TÀI LIỆU INTERNET 48 Bộ y tế, 2002 Các tiêu vi sinh vật thực phẩm Truy cập ngày 14 tháng năm 2009 49 Dương Văn Hợp Nguyễn Lân Dũng, 2007 Phân loại vi sinh sinh học phân tử Truy cập ngày 15 tháng năm 2009 50 FAO/WHO (Food and Agriculture Organization/World Health Organization), 2006 Enterobacter sakazakii and Salmonella in powdered infant formula Microbiological Risk Assessment Series, Meeting Report series 10 Truy cập 44 ngày 30 tháng năm 2009 51 FDA (Food and Drug Administration), 2002a Isolation and enumeration of Enterobacter sakazakii from dehydated powdered infant formula Truy cập ngày 20 tháng năm 2009 52 FDA (Food and Drug Administration), 2002b Health professionals letter on Enterobacter sakazakii infections associated with use of powdered (dry) infant formulas in neonatal intensive care units Truy cập ngày 23 tháng năm 2009 53 FDA-CFSAN (Food and Drug Adminstration-Center for Food Safety and Applied Nutrition), 2002 Isolation and enumeration of Enterobacter sakazakii from dehydrated powdered infant formula Truy cập ngày 20 tháng năm 2009 45 Phụ lục 1: Thành phần môi trường sử dụng Buffered Peptone Water (BPW) Peptone 10,0 g Sodium chloride 5,0 g Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 9,0 g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g Nước 1000 ml pH = 7,2 ± 0,2, tiệt trùng 121oC 15 phút Modified Lauryl Sunfate Tryptone (mLST) = môi trường LST + 29,22 g NaCl + 10 mg/l vancomycin Tryptose 20,0 g Lactose 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Sodium lauryl sulfate 0,1 g Di-potassium hydrogen phosphate 2,75 g Potassium dihydrogen phosphate 2,75 g NaCl 29,22 g Vancomycin 10 mg Nước 1000 ml pH = 6,8 ± 0,2, tiệt trùng 121oC 15 phút Tryptic Soy Agar (TSA) Peptone from casein 15,0 g Peptone from soymeal 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Agar - agar 15,0 g Nước 1000 ml pH = 7,3 ± 0,2, tiệt trùng 121oC 15 phút 46 Thành phần môi trường sử dụng (tiếp theo) Phenol Red Broth Base Peptone from casein 5,0 g Peptone from meat 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Phenol red 0,018 g Nước 1000 ml Nutrient agar (NA) Peptone 15,0 g Yeast extract 3,0 g Sodium chloride 6,0 g D (+) glucose 1,0 g Agar - agar 12,0 g Nước 1000 ml Glucose Phenol Red Broth Base 15,0 g Đường sorbitol 10,0 g Nước 1000ml Lactose Phenol Red Broth Base 15,0 g Đường sorbitol 10,0 g Nước 1000 ml 47 Thành phần môi trường sử dụng (tiếp theo) Saccharose Phenol Red Broth Base 15,0 g Đường saccharose 10,0 g Nước 1000 ml Sorbitol Phenol Red Broth Base 15,0 g Đường sorbitol 10,0 g Nước 1000 ml 48 Phụ lục 2: Tiêu chuẩn Việt Nam Bộ Y Tế tiêu vi sinh vật sữa bột TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5538 : 2002 Chỉ tiêu vi sinh vật sữa bột Tên tiêu Mức cho phép Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc g sản phẩm 5.104 Nhóm coliform, số vi khuẩn g sản phẩm 10 E.Coli, số vi khuẩn g sản phẩm Salmonella, số vi khuẩn 25 g sản phẩm Staphylococcus aureus, số vi khuẩn g sản phẩm 10 Clostridium perfringen, số vi khuẩn g sản phẩm Baccillus cereus, số vi khuẩn g sản phẩm 102 Nấm men nấm mốc, số khuẩn lạc g sản phẩm 10 49 Tiêu chuẩn Việt Nam Bộ Y Tế tiêu vi sinh vật sữa bột (tiếp theo) Quy định Bộ Y Tế - 2002 CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THỰC PHẨM Sữa bột dành cho trẻ em đến 12 tháng tuổi Tên tiêu Mức cho phép Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc g sản phẩm 104 Coliforms, số vi khuẩn g sản phẩm 10 E coli, số vi khuẩn g sản phẩm Salmonella, số vi khuẩn 25 g sản phẩm Staphylococcus aureus, số vi khuẩn g sản phẩm Baccillus cereus, số vi khuẩn g sản phẩm Nấm men nấm mốc, số khuẩn lạc g sản phẩm 102 Sữa bột Tên tiêu Mức cho phép Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc g sản phẩm 5.104 Coliforms, số vi khuẩn g sản phẩm 10 E coli, số vi khuẩn g sản phẩm Salmonella, số vi khuẩn 25 g sản phẩm Staphylococcus aureus, số vi khuẩn g sản phẩm 10 Clostridium perfringens, số vi khuẩn g sản phẩm Baccillus cereus, số vi khuẩn g sản phẩm 102 Nấm men nấm mốc, số khuẩn lạc g sản phẩm 10 50 Phụ lục 3: Sự thay đổi môi trường tăng sinh chọn lọc mLST/vancomycin sau 24 ủ 44oC hình thành khuẩn lạc môi trường TSA sau 24 ủ 37oC 40 mẫu sữa bột Đục Khuẩn lạc Mẫu X V 21 K X T 22 K K 23 X V Mẫu Đục Khuẩn lạc X V 24 X V X T 25 X V K 26 X V X T 27 X V X T 28 X V X T 29 K 30 T 31 K K 32 K K 10 11 X 12 K X V 13 X T 33 14 X T 34 15 X T 35 16 X T 36 17 X T 37 K 18 X T 38 K K 39 K T 40 19 20 X X V K X X V V Ghi chú: V: Khuẩn lạc vàng, T: Khuẩn lạc trắng đục, K: Khơng có hình thành khuẩn lạc 51 Phụ lục 4: Kết sinh hoá chủng gốc mẫu sữa nhiễm E sakazakii kit IDS 14GNR Phản Mẫu sữa Chủng gốc 24 27 28 30 34 Oxidase - - - - - - - - Glucose + + + + + + + + Nitrat + + + + + + + + ONPG + + + + + + + + Urease - - - - - - - - PAD - - - - - - - - Citrate + + + + + + + + Esculin + + + + + + + + H2 S - - - - - - - - Indol - - - - - - - - VP + - - + + + + + Malonate - - - - - - - - LCD - - - - - - - - Di động + + + + + + + + ứng 52 PHỤ LỤC Phụ lục 5: Các mẫu sữa kiểm nghiệm Mẫu Nhãn hiệu Dạng đóng gói Độ tuổi sử dụng Nơi mua Ngày sản xuất Hạn sử dụng Sữa bột kem béo Hà Lan Bịch nhựa 500gr >6 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 04/12/2009 4/12/2010 Sữa bột nguyên kem Hà Lan Bịch nhôm 500gr >6 tuổi Chợ Hòa Hưng, Q10 26/03/2009 26/03/2010 Sữa bột béo Hòa Lan Bịch nhựa 500gr >3 tuổi Chợ Tân Kiểng, Q7 03/01/2009 03/01/2010 Sữa bột béo Hà Lan Bịch nhựa 500gr >2 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 26/11/2008 26/11/2009 Sữa Úc Gold Pro Bịch nhôm 500gr >3 tuổi Chợ Củ Chi, huyện Củ Chi 12/05/2008 12/05/2009 Sữa bột béo Bịch nhựa 500gr tháng tới tuổi Chợ Bình Tây, Q6 04/01/2009 04/01/2010 Sữa bột Hà & Lan Bịch nhựa 450gr >3 tuổi Chợ Phạm Thế Hiển, Q8 18/07/2008 18/07/2009 Sữa bột nguyên kem giàu canxi Bịch nhơm 500gr >6 tuổi Chợ Rạch Ơng, Q8 23/02/2009 23/02/2010 Sữa bột dinh dưỡng Bịch nhựa 500gr >3 tuổi Phố sữa Nguyễn Thông, Q3 20/06/2008 20/06/2009 10 Sữa Mĩ Intellac Bịch nhôm 500gr >2 tuổi Chợ Bình Tây 12/04/2008 12/04/2009 11 Sữa bột nguyên kem Dollac Bịch nhôm 400gr >6 tuổi Chợ Thủ Đức, Q Thủ Đức 23/12/2008 23/12/2009 12 Sữa bột Smart - Gold Hộp giấy 400gr 3 tuổi Chợ Phạm Văn Hai, Q Tân Bình 04/07/2009 04/07/2010 15 Sữa bột nguyên kem tan nhanh Bịch nhôm 500gr >6 tuổi Chợ Bàu Cát, Q Tân Bình 02/08/2009 02/08/2010 16 Sữa bột nguyên kem béo lạt Bịch nhơm 400gr >2 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 02/09/2009 02/09/2010 17 Sữa bột dinh dưỡng tiên tiến Hộp giấy 400gr 2 tuổi Chợ Nhật Tảo, Q10 25/03/2009 25/03/2010 19 Sữa bột cân ký Bịch 1kg Không Chợ Cầu Muối, Q1 Không Không 20 Sữa bột nguyên kem Intellac Bịch nhôm 500gr >6 tuổi Chợ Tân Định, Q1 29/05/2008 29/05/2009 53 Các mẫu sữa kiểm nghiệm (tiếp theo) Mẫu Nhãn hiệu Dạng đóng gói Độ tuổi sử dụng Nơi mua Ngày sản xuất Hạn sử dụng 21 Sữa bột nguyên kem Bịch nhựa 500gr >2 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 21/04/2009 21/04/2010 22 Sữa bột cân ký Bao 50 kg Khơng Chợ Bà Chiểu, Q Bình Thạnh Khơng Khơng 23 Sữa bột cân ký Bịch 500gr Không Chợ Thị Nghè, Q Bình Thạnh Khơng Khơng 24 Sữa bột ngun kem Bịch nhựa 500gr >1 tuổi Phố sữa Nguyễn Thông, Q3 23/10/2008 23/10/2010 25 Sữa bột nguyên kem Hòa Lan Bịch nhựa 500gr >6 tháng tuổi Chợ An Khánh, Q2 26/11/2008 26/11/2009 26 Sữa bột không béo bổ sung canxi Bịch nhôm 400gr tháng tới tuổi Chợ Thanh Đa, Q Bình Thạnh 02/09/2008 02/09/2009 27 Sữa bột phát triển toàn diện Hộp giấy 400gr 2 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 20/02/2009 20/02/2010 29 Sữa bột nguyên kem uống liền Bịch nhôm 400gr >1 tuổi Phố sữa Nguyễn Thông 26/04/2009 26/04/2011 30 Sữa bột trẻ em Hộp 500gr >3 tuổi Chợ Phạm Thế Hiển, Q8 20/04/2009 20/04/2010 31 Sữa bột nguyên kem Hộp thiếc 330gr >2 tuổi Siêu thị Coopmart, Q10 21/11/2008 21/11/2009 32 Sữa bột nguyên kem Hộp thiếc 400gr >6 tuổi Chợ Hòa Hưng, Q10 13/01/2009 13/01/2010 33 Sữa bột nguyên kem Bịch nhựa 500gr tháng tới tuổi Siêu thị Big C, Q10 12/4/2008 12/04/2010 34 Sữa bột nguyên kem Bao 50 kg >2 tuổi Chợ Phạm Văn Hai, Q Tân Bình Khơng Khơng 35 Sữa bột béo Hộp giấy 450gr 6 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 04/01/2009 04/06/2010 37 Sữa bột nguyên kem uống liền Hộp giấy 450gr >3 tuổi Siêu thị Big C, Q10 26/12/2008 26/12/2009 38 Sữa bột béo tan nhanh Bịch nhựa 500gr >6 tháng tuổi Siêu thị Coopmart, Q10 03/06/2008 03/12/2009 39 Sữa bột béo Hộp thiếc 500gr >2 tuổi Chợ Phú Lâm, Q6 25/04/2009 25/04/2010 40 Sữa bột tăng trưởng chiều cao Hộp giấy 450gr >6 tuổi Chợ Thủ Đức, Q Thủ Đức 08/03/2009 08/03/2010 54 49 ... petri, ống Durham, ống nghiệm, pipette, que cấy… 3.3.2 Thi t bị Thi t bị sử dụng trình bày Bảng 3.2 21 Bảng 3.2: Các thi t bị sử dụng kiểm nghiệm Thi t bị Nhãn hiệu Công dụng Cân điện tử 100 g ± 0,05... Mẫu kiểm nghiệm chủng gốc E sakazakii 20 3.2.2 Mơi trường hố chất 20 3.3 Dụng cụ thi t bị 21 3.3.1 Dụng cụ 21 3.3.2 Thi t bị 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Quy trình phân lập 22 3.4.1.1... người trưởng thành kể người già (Drudy ctv, 2006) Đặc biệt trẻ có hệ miễn dịch chưa hồn thi n, trẻ sinh thi u tháng hay trẻ có trọng lượng thấp sau sinh, có nguy nhiễm E sakazakii cao so với trẻ