Phân tích các vitamin nhóm b trong sữa bột trẻ em bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - VŨ THỊ THU HƯƠNG PHÂN TÍCH CÁC VITAMIN NHĨM B TRONG SỮA BỘT TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC M· sè: 2.76 HÀ NỘI - 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ THỊ THU HƯƠNG PHÂN TÍCH CÁC VITAMIN NHÓM B TRONG SỮA BỘT TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) NGÀNH HÓA CƠ BẢN MÃ SỐ: LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Tạ Thị Thảo HÀ NỘI - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn thân thực hiện, kết nghiên cứu đưa luận văn thân chưa nghiên cứu, sử dụng công bố tạp chí khoa học trước đây, số liệu kết nghiên cứu thực cách trung thực xác LỜI CẢM ƠN  Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Tạ Thị Thảo - Khoa Hóa - Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà nội tận tình hướng dẫn chun mơn, phương pháp nghiên cứu tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học thầy, giáo Khoa Cơng nghệ Hóa học – Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành nội dung học tập thực đề tài thuận lợi Xin trân trọng cảm ơn bạn đồng nghiệp Ds Trần Cao Sơn, CN Vũ Thị Trang, Ban giám đốc, lãnh đạo cán Labo Hóa độc thực phẩm - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia tạo điều kiện, giúp đỡ chúng tơi q trình triển khai nghiên cứu đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, bạn lớp Cao học Hóa 2007 - 2009 giúp đỡ động viên hai năm học tập trình làm luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Vũ Thị Thu Hương MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, PHỤ LỤC MỞ ĐẦU 12 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 14 1.1 Sữa thành phần sữa 14 1.1.1 Nước 14 1.1.2 Cacbohydrat 14 1.1.3 Chất béo 15 1.1.4 Protein 16 1.1.5 Vitamin, khoáng chất enzym 17 1.1.5.1 Vitamin A 17 1.1.5.2 Vitamin C 18 1.1.5.3 Vitamin D 18 1.1.5.4 Vitamin E 18 1.1.5.5 Vitamin K 18 1.1.5.6 Các khoáng chất 18 1.1.5.7 Enzymes 19 1.2 Vitamin nhóm B sữa 20 1.2.1 Tên gọi, cấu trúc, cơng thức cấu tạo vitamin nhóm B 20 1.2.2 Vai trò vitamin nhóm B sữa 21 1.2.3 Tính chất vitamin nhóm B sữa 22 1.2.3.1 Thiamine (vitamin B1) 22 1.2.3.2 Riboflavin (vitamin B2) 22 1.2.3.3 Niacin (vitamin PP) 22 1.2.3.4 Pantothenic acid (vitamin B5) 23 1.2.3.5 Pyridoxine (vitamin B6) 23 1.2.3.6 Muối folat (vitamin B9) 23 1.2.3.7 Cyanocobalamin (vitamin B12) 23 1.2.4 Độc tính vitamin nhóm B 23 1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC – công cụ ứng dụng 25 hữu hiệu để phân tích thành phần dinh dưỡng thực phẩm 25 1.3.1 Nguyên tắc chung phương pháp HPLC 25 1.3.2 Pha tĩnh HPLC 26 1.3.3 Pha động HPLC 27 1.3.4 Các loại detector HPLC 28 1.3.5 Một số đại lượng đặc trưng HPLC 29 1.3.6 Phân tích định tính HPLC 31 1.3.7 Phân tích định lượng HPLC 32 1.3.8 Phương pháp sắc ký lỏng hấp phụ pha ngược RP-HPLC 32 1.3.9 Các phương pháp xác định vitamin nhóm B thực phẩm 33 1.4 Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC phân tích vitamin tan nước nhóm B sữa 34 1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược (RP-HPLC) sử dụng detector PDA (Photo – diode - array) 34 1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion sử dụng cột tách pha ngược RP-LC, detector UV35 1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang 36 1.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector PDA với chế độ chạy rửa giải gradient 36 1.4.5 Các phương pháp xử lý mẫu 37 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 41 2.1 Đối tượng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 40 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 40 2.1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 40 2.2 Hóa chất, thiết bị phương pháp nghiên cứu 41 2.2.1 Chất chuẩn, hóa chất thuốc thử 41 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 42 2.2.3 Mẫu phân tích 43 2.3 Phương pháp nghiên cứu 43 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu sữa 43 2.3.2 Phương pháp phân tích điều kiện chạy sắc ký 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích 45 3.1.1 Tối ưu hoá điều kiện xác định Vitamin nhóm B HPLC 45 3.1.1.1 Chọn van bơm mẫu 45 3.1.1.2 Chọn cột tách 46 3.1.1.3 Chọn Detector 46 3.1.1.4 Chọn bước sóng phát 47 3.1.1.5 Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 48 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu 58 3.1.2.1 Khảo sát dung dịch chiết mẫu 58 3.1.2.2 Độ thu hồi phương pháp 59 3.1.2.3 Độ lệch chuẩn 61 3.2 Nghiên cứu đánh giá phương pháp phân tích 63 3.2.1 Khảo sát lập đường chuẩn 63 3.2.2 Giới hạn phát LOD 67 3.2.3 Giới hạn định lượng LOQ 71 3.2.4 Giới hạn tuyến tính (LOL) 71 3.2.5 Khoảng tuyến tính 71 3.2.6 Độ xác phương pháp 72 3.2.6.1 Độ 72 3.2.6.2 Độ chụm 73 3.2.6.3 Độ xác 75 3.2.7 Độ tái lặp phương pháp (Đánh giá độ xác phương pháp phịng thí nghiệm) 77 3.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 80 3.3.1 Quy trình xử lý mẫu 80 3.3.2 Kết phân tích thực tế 82 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 TÓM TẮT NGHIÊN CỨU 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 PHỤ LỤC 98 Phụ lục 1: Một số sắc đồ khảo sát tối ưu hóa điều kiện sắc ký 98 Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát lập đường chuẩn 100 Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu 103 Phụ lục 4: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực 105 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril UV/VIS Ultraviolet-visible spectrophotometry Quang phổ tử ngoại khả kiến PDA Photo Diode Array Chuỗi điốt quang ND Not detected NC Not compared Không thực so sánh SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối theo of Horwitz’s cơng thức tính Horwitz Degrees of freedoms Bậc tự RSDH DF MINITABS Dưới giới hạn phát phương pháp Phần mềm phân tích thống kê DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.Thông tin chung số vitamin nhóm B Bảng 1.2 Mức hấp thụ cho phép số vitamin Bảng 3.1.Thời gian lưu bước sóng hấp thụ cực đại vitamin tan nước nhóm B Bảng 3.2 Thời gian lưu vitamin thành phần pha động khác Bảng 3.3 Thành phần pha động Bảng 3.4 Chương trình rửa giải gradient pha động Bảng 3.5 Các loại tốc độ dòng lựa chọn tương ứng cho loại cột tách Bảng 3.6 Kết khảo sát tốc độ dịng Bảng 3.7 Diện tích pic vitamin nồng độ TCA khác Bảng 3.8 Độ thu hồi phương pháp xác định vitamin mẫu sữa bột M8 03 mức thêm chuẩn khác Bảng 3.9 Độ thu hồi phương pháp xác định vitamin mẫu sữa bột DDP1tại 03 mức thêm chuẩn khác Bảng 3.10 Độ lệch chuẩn phương pháp xác định vitamin tan nước nhóm B mẫu sữa bột Bảng 3.11.Sự phụ thuộc nồng độ vitamin diện tích pic tương ứng Bảng 3.12 Độ tuyến tính đường chuẩn vitamin tan nước nhóm B Bảng 3.13 Giới hạn phát (LOD) phương pháp Bảng 3.14 Giới hạn phát (LOD) theo phương pháp lý thuyết tính theo phương trình đường chuẩn Bảng 3.15 Giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Lê Trung Sơn (2005), Xác định số hợp chất hữu phương pháp sắc ký lỏng có độ phân giải cao (HPLC), Luận văn thạc sĩ khoa học, 2005 [2] Lê Hoàng (2006), Xác định phụ gia thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Luận văn thạc sĩ khoa học, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội [3] Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đề phương pháp tách chất [4] Nguyễn Thị Vân Thành (2006), Tách xác định đồng thời Tetracylines thức ăn gia súc phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Khoá luận tốt nghiệp, 2006 [5] Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003) Hoá học phân tích - Phần 2: Các phương pháp phân tích cơng cụ [6] Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê hố phân tích [7] Vũ Thị Trang (2007), Phân tích xác định hàm lượng Clenbuterol thịt gia súc, gia cầm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội TIẾNG ANH [8] Aberto Zafra-Gómez, Antonio Garballo, Juan C Morales, Luis E GarciaAyuso, Simultaneous Determination of Eight Water-soluble vitamins in Supplemented food by Liquid Chromatography, J.Agric Food Chem., (2006), 54, 4531- 4536 [9] Andrew Guzzetta, Stanford University, Stanford, CA, USA, Reverse Phase HPLC Basics for LC/MS Andrew Guzzetta, [10] http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htm#Solvents Analytical Methods Committee, Analyst., (2000), 125, 353 - 358 95 [11] C.Y.M Ang and F.Moseley, Determination of thiamin and riboflavin in meat and meat products by high-pressure liquid chromatography, J Agric Food Chem., (1980), 28, 483 - 487 [12] Chapterurl=http://www.nal.usda.gov/fnic/DRI//DRI_Thiamin/150195_150.pdf [13] D.T Burn, C.Makey, Comparison of reversed-phase and adsorption modes of high- performance liquid chromatography for the assay of fat soluble vitamins in multivitamin tablets, J.chromatogr., (1980), 200, 300 - 304 [14] E.C Nicolas, K.A Pfender, Fast and simple liquid chromatographic determination of nonphosphorylated thiamine in infant formula, milk, and other foods, J.Assoc Off Anal Chem, (1990), 73(5), 792 (7) [15] Eva Barna, Erno Dworschák, Determination of thiamine (vitamin B1) and Riboflavin (vitamin B2) in meat and liver by high performance liquid chromatography, J.Chromatogr.A., (1994), 668, 359-363 [16] F.L Lam, I.J Holcomb, S.A Fusari, Liquid chromatographic assay of ascorbic acid, niacinamide, pyridoxine, thiamine, and riboflavin in multivitamin-mineral preparations, J.Assoc Off Anal Chem., (1984), 67, 1007 (10) [17] F.Arella, S.Lahély, J.B Bourguignon, C Hasselmann, Liquid chromatographic determination of vitamins B1 & B2 in food A collaborative study, Food Chemistry., (1996), 56 (1), 81-86 [18] Gary L Long, J D Winefordner, Limit of detection A closer look at the IUPAC definition, Anal Chem., (1983), 55 (7), 712A–724A [19] I.F Kamman, T.P Labuza and I.I Warthsen, Thiamin and riboflavin analysis by high performance liquid chromatography J.Food.Sci., (1980), 45, 1497- 1502 [20] Juha Knuutinen, Pasi Harjula, Identitfication of fish species by reversedphase high performance liquid chromatography with photodiode-array detection, J Chromatogr.B, (1998), 705, 11-21 96 [21] J.K.Fellman, W.E Artz, P.D Tassinari., C.L.Cole, J.Augustin, Simultaneous Determination of Thiamin and Riboflavin in Selected Foods by High-Performance Liquid Chromatography, J.Food.Sci., (1982), 47, 2048 - 2052 [22] L.Havlíková, L.Matysová, L Nováková, P.Solich, HPLC determination of calcium pantothenate and two preservatives in topical cream, J.Phar and Bio Analysis., (2006), 41, 671-675 [23] M Bergaentzlé, A.Arella, J.B Bourguignon, C Hasselmann, Determination of vitamin B6 in foods by HPLC – a collaborative study, Food Chemistry., (1995), 52, 81-86 [24] Magdalene Xenou Kokoletsi, Stella Kafkala, Michael Tsiaganis, A novel gradient HPLC method for simultaneous determination of ranitidine, methyl parable and propylparaben in oral liquid pharmaceutical formulation, J Pharm and Biomedical analysis, (2005), 38, 763-767 [25] National Academy of Sciences Institute of Medicine Food and Nutrition Board., ed (1998), Chapter - Niacin1 [26] National Academy of Sciences Institute of Medicine Food and Nutrition Board., ed (1998), Chapter - Thiamin2 [27] National Academy of Sciences Institute of Medicine Food and Nutrition Board., ed (1998), Chapter - Folate [28] Oliver Heudi, Tamara Kiline, Patric Fontannaz, Seperation of watersoluble vitamins by reversed-phased high performance liquid chromatography with ultra-violet detection: Application to polyvitaminated premixes, J Chromatogr.A., (2005), 1070, 49-56 [29] Pilar Vinas, Carmen Lospez-Erroz, Nuria Balsalobre, Manuel HarnándezCórdoba, Reversed-phase liquid chromatography on amide srationary phase for the determination of the B group vitamins in baby foods, J Chromatogr.A., (2003), 1007, 77-84 [30] P.Moreno, V.Salvadó, Determination of eight water- and fat-soluble 97 vitamin in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high performance liquid chromatography, J Chromatogr.A., (2000), 870, 207-215 [31] Soledad Albalá-Hurtado, M.Teresa Veciana-Nogués, Maria IzquierdoPulido, Abel Mariné-Font, Determination of water-soluble vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography, J Chromatogr.A., (1997), 778, 247-253 [32] S.Otles, Y Hisil, Ital High pressure liquid chromatographic analysis of water soluble vitamins in eggs, J.Food.Sci., (1993) 69 (12) [33] Shulamit Levin, Gradient Operation In HPLC, Analytical Department scientific and applicative support of Waters Astommers in Israel, http://www.forumsci.co.il/HPLC [34] R.B Toma and M.M Tabekhina, High performance liquid chromatographic analysis of B-vitamin in rice and rice products, J.Food.Sci., (1979), 44, 263 [35] R.G Skurray, A rapid method for selectively determining small amounts of niacin, riboflavin and thiamine in foods, J.Food Chem., (1981), 7, 77 [36] R.B.H Wills, P Wimalasiri and H Greenfield, J.Micro-nutrient Anal., (1985), 1, 23 [37] W.Horwitz, Evaluation of analytical methods used for regulation of foods and drugs, Anal.Chem., 1982, 54(1), 67A-76A [38] http://www.milkfacts.info/Nutrition%20Facts/Milk%20and%20Human%20 Healt h.htm Đại học Cornell – United States [39] http://en.wikipedia.org/wiki/B_vitamins 98 PHỤ LỤC 12 10 16 14 18 22 20 100 mAU PP 11.541 1162201 53407 50 mAU 100 Name Retention Time Area Height B1 21.696 1709108 123092 4: 246 nm, nm B Group mix B TF 0.8.lan2.dat B6 17.003 230839 14607 B12 17.333 506134 38179 B2 18.005 1505645 109783 B9 15.563 467568 26406 Phụ lục 1: Một số sắc đồ khảo sát tối ưu hóa điều kiện sắc ký Khảo sát tốc độ pha động 50 24 Minutes 4: 246 nm, nm B Group mix B 14.04 TF 0.9ppm.dat 150 10 12 16 14 18 B1 20.480 1499870 139053 20 100 mAU B9 14.880 526161 37366 PP 10.848 1068062 60636 50 mAU 100 Name Retention Time Area Height B6 15.723 208958 15693 B12 16.427 555487 37552 B2 16.843 1225447 115855 17.568 182 46 150 Tốc độ dòng 0, ml/phút 50 22 24 Minutes 10 12 14 16 Minutes Tốc độ dòng 1ml/phút mAU 100 B1 20.149 1353348 50 mAU 100 Name Retention Time Area B9 14.944 460436 PP 9.973 937350 4: 246 nm, nm B mix B 04.dat B6 15.883 212326 B12 16.437 459296 B2 16.885 1266783 Tốc độ dòng 0, ml/phút 18 20 50 22 24 99 10 12 14 16 18 50 mAU 75 B1 17.995 1157309 93377 (B12) B2 14.624 1417137 89251 PP 8.416 804538 46971 50 25 mAU 75 Name Retention Time Area Height 100 B9 12.789 209891 14685 B6 13.184 195014 11785 100 4: 246 nm, nm B Group mix B TF 1.2.dat 25 20 22 24 Minutes Tốc độ dòng 1,2 ml/phút Khảo sát thành phần pha động chế độ isocratic : đệm photphat (pH 3) : ACN PDA-246nm B Name Retenti on Ti me Area Hei ght 250 250 200 (PP) 200 mAU 150 mAU 150 100 100 50 (B6) (B9) 50 0 10 20 15 25 30 35 40 45 50 Minutes Thành phần pha động 95 - PD A-246n m B 500 400 500 Name Retenti on Ti me Area Hei ght 400 (B2) (B6) 200 (B1) (B12) 100 (PP) (B9) 200 mAU 300 mAU 300 0 0 100 5 10 12 15 17 20 22 Minut es Thành phần pha động 90 - 10 25 27 30 32 35 100 Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát lập đường chuẩn 10 12 24 22 20 18 16 14 50 Minutes Chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B (B1-10,6ppm; B2-10 ppm; B3-11,1 ppm; 10 12 14 16 60 40 mAU B9 14.965 160113 20 mAU 40 PP 9.397 348945 60 Name Retention Time Area B1 20.117 656741 4: 246 nm, nm B mix B 2lan.dat B6 15.883 101953 B12 16.437 227768 B2 16.875 608520 B6:10 ppm; B9: 20 ppm; B12: 17.8 ppm) 18 20 20 22 24 Minutes Chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B (B1-5,3ppm; B2-5 ppm; B3-5,55 ppm; B6:5 ppm; B9: 10 ppm; B12: 8,9 ppm) mAU B1 19.371 1381061 100 B12 15.552 776452 B2 15.851 1043711 16.469 43 PP 9.760 821927 50 100 Name Retention Time Area mAU B9 13.952 594206 B6 14.613 154209 4: 246 nm, nm B Group Mix B1 10.6 B2 10 B3 11.1 B6 10 B9 20 B12 17.8ppm02.dat 101 10 12 14 16 10 B1 19.371 250009 18 mAU 20 B12 15.552 149962 B2 15.840 207294 B9 13.941 114253 B6 14.613 32803 20 Name Retention Time Area 10 mAU 9.344 52412 PP 9.792 153349 4: 246 nm, nm B Group Mix 5lan.dat 20 22 24 Minutes Chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B (B1-2.12ppm; B2-2ppm; B3: 2,22 ppm; B6:2 ppm; B9: ppm; B12: 3,56 ppm) 10 12 14 16 mAU 10 B1 20.043 82991 B9 14.869 31308 0 15 B6 15.765 16878 B12 16.384 44682 B2 16.789 114513 10 Name Retention Time Area mAU PP 9.909 90471 15 4: 246 nm, nm B MixB-10lan-2.dat 18 20 22 24 Minutes Chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B (B1:1,06ppm; B2: 1ppm; B3: 1,11 ppm; B6:1 ppm; B9: ppm; B12: 1,78 ppm) 10 10 12 14 16 B1 19.360 37112 mAU B12 15.531 36163 B2 15.829 49758 -5 PP 9.547 46030 mAU 9.749 38933 Name Retention Time Area B9 13.920 37419 B6 14.603 8793 10 4: 246 nm, nm B Group Mix 20lan.dat 18 -5 20 22 24 Minutes Chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B 530 ppb (B1-530ppb; B2-500ppb; B3-555 ppb; B6:500 ppb; B9: 1000 ppb; B12: 890 ppb) mAU 10 15 Name Retention Time Area Height 10 10 12 14 4: 246 nm, nm Vitamin B MixB-L300.dat 12 14 16 16 18 18 mAU 16 B1 19.467 45835 3622 14 B12 15.691 53418 3643 B2 16.021 164709 12336 B6 14.560 5733 562 12 18 20 20 Minutes 20 Chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B 35 ppb 22 22 22 mAU B9 13.653 95019 7080 15 10 23.413 1597 54 B1 19.445 1763 191 10 mAU mAU B1 19.317 4754 B2 17.611 5963 18.101 376 B12 17.088 24774 B9B615.541 15.8193914 5083 PP 10.080 33887 10.773 5206 -2 4: 246 nm, nm B Group mix B-100 lan.dat 18.464 2327 mAU 0.213 73 19 Name Retention Time Area Height PP 9.440 31112 2196 Name Retention Time Area 15.243 1363 111 (B12) B215.979 15.7332522 536 336 71 16.341 9848 1187 B6 13.792 938 129 PP 9.237 9.483 3122 1849 744 205 8.075 14576 235 B9 12.619 32865 2149 102 -2 Minutes 24 Chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B 106 ppb 4: 246 nm, nm Vitamin B Mix B stock_L200.dat 15 10 Minutes 24 Chuẩn hỗn hợp 06 vitamin nhóm B 53 ppb 15 10 24 103 Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu Khảo sát nồng độ dung dịch TCA chiết mẫu nồng độ khác 10 12 14 18.773 185884 16314 (B1) 16 18 25 mAU PP 8.928 289970 25395 25 mAU -25 (B12) B2 15.445 306687 25471 50 Name Retention Time Area Height B9 13.867 5656 645 B6 14.272 10129 730 50 4: 246 nm, nm Vitamin B M8-2 TCA 1% 5.3257g.dat -25 20 22 24 Minutes 10 14 12 16 18 20 mAU PP 9.216 300462 34616 mAU 20 Name Retention Time Area Height 40 (B1) 18.987 196184 17481 4: 246 nm, nm Vitamin B M8-3- TCA 2% 5.4991g.dat (B12) B2 15.648 310854 25275 B9 B6 14.144 14.357 5248 4058 541 534 40 Nồng độ dung dịch TCA 1% 20 Minutes Nồng độ dung dịch TCA 2% 10 12 14 16 (B1) 18.987 169718 15432 18 Minutes Nồng độ dung dịch TCA 4% 20 10 20 22 24 mAU 30 B9 14.357 14.155 3665 4550 508 472 B6 (B12) B2 15.637 263015 22046 8.981 6917 971 PP 9.312 195092 28310 10 20 Name Retention Time Area Height mAU 30 4: 246 nm, nm Vitamin B M8-4- TCA 2% 5.6293g.dat 104 5490 589 B9 14.325 14.165 4645 651 B6 (B12) B2 15.627 307195 26576 10 12 14 16 18 20 mAU 40 (B1) 18656 18.987 198593 20 8.864 172858 31444 PP 9.248 398028 25098 Name Retention Time Area Height mAU 40 4: 246 nm, nm Vitamin B M8-7- TCA 5% 5.5208g.dat 20 22 24 Minutes Nồng độ dung dịch TCA 5% 10 12 14 16 18 Minutes Nồng độ dung dịch TCA 6% 20 20 22 24 mAU 18.987 (B1) 196076 17280 PP 9.259 329670 25915 20 B9 14.187 5523 B6 14.325 3648 538 524 (B12) B2 15.637 304110 26294 40 Name Retention Time Area Height mAU 40 4: 246 nm, nm Vitamin B M8-9-TCA-6% 5.4626g.dat 105 10 12 14 16 75 50 mAU 9.707 711227 56011 -25 25 mAU 50 Retention Time Area Height 19.371 312902 30043 19.744 1184 175 13.899 143848 15491 14.549 38701 3016 75 4: 246 nm, nm B Group DDP-1-b-5.9435-5mlc-25ml.dat 15.552 15.819 365191 37559123765 9267 16.320 3714 385 Phụ lục 4: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực 25 -25 20 18 22 24 Minutes B1 19.371 307876 100 mAU B9 13.899 143848 B6 14.549 38701 100 Name Retention Time Area 50 mAU PP 9.707 771360 4: 246 nm, nm B Group DDP-1-b-5.9435-5mlc-25ml.dat B12 15.552 120661 B2 15.819 356254 Mẫu sữa bột DDP-1 50 0 10 12 14 16 18 20 22 24 Minutes 150 Mẫu sữa bột DDP-1 + chuẩn hỗn hợp vitamin nhóm B – 950 ppb 150 0 10 mAU B2 15.851 321460 100 50 (B12) B913.920 13.72812474 5844 B6 14.560 25553 50 PP 9.685 2288970 mAU 100 Name Retention Time Area B1 19.413 314792 4: 246 nm, nm B Group DP2b-5.1716g-25ml.dat 12 14 16 Minutes Mẫu sữa bột DDP-2 18 20 22 24 106 10 12 200 mAU 300 B1 19.456 310990 (B12) B2 15.904 86295 B6 14.624 36493 PP 9.771 1667261 300 200 100 mAU 400 Name Retention Time Area B9 13.728 5145028 400 4: 246 nm, nm B Group DP4b-cu-5.1258g-25ml.dat 100 14 16 18 20 22 24 Minutes Mẫu sữa bột DDP-4 PP 9.771 355687 10 B1 19.531 141585 40 20 mAU 20 40 Name Retention Time Area mAU B9 14.005 12833 B6 14.635 10270 14.763 5095 B12 15.381 347 B2 15.968 180341 4: 246 nm, nm B group M7-1-6.396g-25ml.dat 12 14 16 18 20 22 24 Minutes Mẫu sữa bột DL Gold Step - M7 10 12 14 40 16 B1 20.128 304491 B6 15.787 18106 B12 16.107 2940 B2 16.853 452140 B9 14.880 28468 PP 9.835 65643 40 20 mAU 60 Name Retention Time Area 18 Minutes Mẫu sữa bột DL Gold Step - M8 20 20 22 24 mAU 60 4: 246 nm, nm B 1-6.5677g-25ml.dat 80 107 4: 246 nm, nm B Mau nap C2-5.5009g-01.dat 80 10 12 14 B6 15.797 36966 B12 16.416 66360 B2 16.843 509544 17.323 631 16 mAU 40 B1 20.096 458221 20 mAU PP 9.824 49885 B9 14.912 30629 60 40 60 Name Retention Time Area 18 20 20 22 24 Minutes Mẫu DL Gold Step 2- M8 + chuẩn hỗn hợp vitamin nhóm B 950 ppb B1 20.064 243516 10 12 14 50 40 30 B6 15.733 15652 (B12) B2 16.800 366048 10 PP 9.707 608751 B9 14.848 22794 30 20 mAU 40 Name Retention Time Area 16 mAU 50 4: 246 nm, nm B Mau nap C1-5.6048g-01.dat 20 10 18 20 22 24 Minutes 1500 Mẫu DL Gold Step -M8 + chuẩn hỗn hợp vitamin nhóm B 190 ppb 4: 246 nm, nm B group 444-2_5.1214g-25ml.dat B1 19.552 215404 26474 1000 mAU (B12) B2 15.957 66932 8827 PP 9.728 133913 15736 500 mAU 1000 Name Retention Time Area Height (B9) B6 14.667 214735 22285 1500 500 0 10 12 14 16 Minutes Mẫu sữa bột 0409444-2 18 20 22 24 108 10 14 16 18 mAU 19.381 157353 13984 (B1) B6 14.603 1907 351 B9 13.984 3099 486 12 (B12) B2 15.915 160898 14404 100 12.405 2261462 122253 -100 mAU Name Retention Time Area Height PP9.643 9.504480364 66543036544 69107 100 4: 246 nm, nm B Group Mau 452-1b 5.1219g-25ml.dat -100 20 22 24 Minutes 10 12 14 B1 19.552 215404 26474 (B12) B2 15.957 66932 8827 -50 (B9) B6 14.667 214735 22285 PP 9.728 133913 15736 50 100 Name Retention Time Area Height mAU 150 4: 246 nm, nm B group 444-2_5.1214g-25ml.dat 16 18 100 50 mAU 150 Mẫu sữa bột 0409452-1 -50 20 22 24 Minutes Mẫu sữa bột 0409452-2 10 12 14 Minutes Mẫu sữa bột 0409358-2 16 B1 20.021 50455 6439 18 20 25 -25 22 mAU 50 (B12) B2 16.512 271334 29288 B9 14.411 23761 2593 B6 14.976 18358 2527 PP 10.069 221482 15425 25 Name Retention Time Area Height -25 mAU 50 4: 246 nm, nm B Group Mau 358-2a 5.1109g-25ml.dat ... Nam, Vinamilk… bao gồm loại sản phẩm sau: Sữa b? ??t 123, Sữa b? ??t 456, Sữa b? ??t Step 1, Sữa b? ??t step 2, Sữa b? ??t DL 123 Gold 4000, Sữa b? ??t DL 456 Gold 900, Sữa b? ??t DL Gold Step 1, Sữa b? ??t DL GOLD step... hiệu cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, sắc ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân b? ?? lỏng- lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp. .. triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC để xác định đồng thời 08 vitamin tan nước 37 mẫu sữa b? ??t sữa tươi Các vitamin vitamin thường có mặt nhiều loại thực phẩm b? ?? sung (sữa b? ??t trẻ em, sữa trẻ