KIỂM NGHIỆM Enterobacter sakazakii TRONG SỮA BỘT TRẺ EM THEO PHƯƠNG PHÁP FDA CÓ CẢI TIẾN

5BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KIỂM NGHIỆM Enterobacter sakazakii TRONG SỮA BỘT TRẺ EM THEO PHƯƠNG PHÁP FDA CÓ CẢI TIẾN Họ tên sinh viên: NGUYỄN PHƯƠNG THẢO Ngành: BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN NƠNG SẢN THỰC PHẨM Niên khóa: 2005 - 2009 Tháng 8/2009 KIỂM NGHIỆM Enterobacter sakazakii TRONG SỮA BỘT TRẺ EM THEO PHƯƠNG PHÁP FDA CÓ CẢI TIẾN Tác giả NGUYỄN PHƯƠNG THẢO Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp kỹ sư ngành Bảo Quản Và Chế Biến Nông Sản Thực Phẩm Giáo viên hướng dẫn: T.S VŨ THỊ LÂM AN Th.S VÕ MINH CHÂU Tháng năm 2009 i LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi công ơn sinh thành dạy dỗ cha mẹ khôn lớn thành người, người thân chăm sóc động viên suốt thời gian qua Chân thành ghi nhớ công ơn dạy dỗ thầy cô trường đại học Nông Lâm, đặc biệt thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm, tận tình bảo, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập suốt thời gian ngồi giảng đường đại học Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Vũ Thị Lâm An, giảng viên khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Trường đại học Nơng Lâm, người tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Xin gửi lời cám ơn tới anh Võ Minh Châu anh, chị Cơ Quan Thú Y Vùng giúp đỡ, bảo tạo điều kiện cho em thực luận văn Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến tất bạn bè, người bên tôi chia sẻ suốt quãng đời sinh viên, bạn động viên giúp đỡ nhiều thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Kính chúc người sức khỏe thành công Tôi xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh ngày 10 tháng năm 2009 Nguyễn Phương Thảo ii TÓM TẮT Enterobacter sakazakii vi khuẩn gây bệnh hội, gây bệnh nghiêm trọng như: viêm màng não, nhiễm trùng máu, chết hoại ruột non … với tỉ lệ tử vong từ 40 - 80%, đe dọa mạng sống người, đặc biệt trẻ em Việc sử dụng sữa bột thay nguồn sữa mẹ nguyên nhân chủ yếu dẫn tới xâm nhiễm E sakazakii vào thể trẻ Nhằm đánh giá mức độ nhiễm vi khuẩn sữa bột thực đề tài: “Kiểm nghiệm E sakazakii sữa bột trẻ em theo phương pháp FDA có cải tiến” Đề tài thực Phòng Vi Sinh Cơ Quan Thú Y Vùng - 128 Phạm Thế Hiển, phường 2, quận 8, thành phố Hồ Chí Minh - từ 09/03/2009 đến 31/05/2009 Đề tài tiến hành kiểm nghiệm 40 mẫu sữa bột trẻ em thu mua thành phố Hồ Chí Minh theo phương pháp FDA có cải tiến để xác định tỉ lệ nhiễm E sakazakii đồng thời so sánh tỉ lệ nhiễm E sakazakii sữa bột phương pháp với tỉ lệ nhiễm E sakazakii sữa bột tác giả khác Sau tiến hành thí nghiệm, phát E sakazakii từ 10 mẫu số 40 mẫu sữa bột tiến hành kiểm tra (chiếm 25% tổng số mẫu) Kết kiểm nghiệm E sakazakii sữa bột theo phương pháp FDA (Dương Ngọc Phương, 2008) ISO (Trần Thị Viết Hiếu, 2008) cho thấy, kết phát nhiều mẫu có diện E sakazakii với phương pháp FDA (9,09%) so với phương pháp ISO/TS 22964 (35%) Nghiên cứu số tác giả nước (Muytjen ctv, 1988; Nazarowec - White Farber, 1997; Iversen Forsythe, 2004; Heuvelink ctv, 2001) cho thấy, tỉ lệ nhiễm E sakazakii sữa bột vào khoảng 2-15% thấp nhiều so với kết kiểm nghiệm iii MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Các chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc tính Enterobacter sakazakii 2.1.1 Đặc điểm hình thái, phân loại nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm sinh lí 2.1.3 Đặc điểm sinh hóa 2.1.4 Độc tính E sakazakii 2.2 Tình trạng nhiễm E sakazakii 2.3 Nguồn lây nhiễm 11 2.3.1 Từ thực phẩm 12 2.3.2 Từ môi trường 13 2.4 Phương pháp phát 14 2.4.1 Các phương pháp truyền thống 14 2.4.2 Phương pháp phát nhờ vào chất thị đặc trưng 17 2.4.3 Phương pháp sinh học phân tử 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Vật liệu nghiên cứu 21 3.2.1 Vật liệu 21 iv 3.2.2 Dụng cụ thiết bị 21 3.2.3 Mơi trường hóa chất 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Quy trình kiểm nghiệm 24 3.3.2 Đối chứng kết với chủng E sakazakii gốc 26 3.3.3 Các tiêu cần theo dõi 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kiểm nghiệm E sakazakii theo phương pháp FDA có cải tiến 27 4.2 So sánh tỉ lệ nhiễm E sakazakii sữa bột trẻ em với tác giả khác 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 47 v CÁC CHỮ VIẾT TẮT AES Automotive Engineering Science Laboratory BPW Buffered Peptone Water CAA/RCP Codex Alimentarius Commission/ Recommended International Codes of Practice CCFH Codex Committee on Food Hygiene CDC Center for Disease Control and Prevention CFSAN Center for Food Safety and Applied Nutrition CFU Colony Form Units ctv cộng tác viên DFI Druggan - Forsythe - Iversen DNA Deoxyribonucleic acid E sakazakii Enterobacter sakazakii EE Enterobacteriaceae enrichment ESE Enterobacter sakazakii enrichment ESIA Enterobacter sakazakii isolation agar ESSB Enterobacter sakazakii selective broth FAO Food and Agriculture Organization FDA Food and Drug Administration ICMSF International Commission for Microbiological Specification for Food ISO International Standard Organization mLST modified Lauryl Sulphate Tryptone NA Nutrient agar rRNA Ribosom Ribonucleic acid TSA Trypticase soy agar UV Ultraviolet VRBGA Violet red bile glucose agar WHO World Health Organization vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Một số khác biệt sinh hóa E sakazakii với vi khuẩn khác giống Enterobacter Bảng 2.2: Đặc điểm sinh hóa E sakazakii Bảng 2.3: Các trường hợp nhiễm bệnh rải rác E sakazakii gây giới 11 Bảng 2.4: Phân lập E sakazakii môi trường nhà máy sản xuất sữa bột 12 Bảng 2.5: Các mẫu môi trường kiểm tra diện E sakazakii 14 Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 22 Bảng 3.2: Các mơi trường sử dụng thí nghiệm 22 Bảng 4.1: Kết sinh hóa mẫu có khuẩn lạc trắng môi trường TSA 34 Bảng 4.2: Khả sử dụng đường khuẩn lạc nghi ngờ 35 Bảng 4.3: Kết sinh hóa 10 mẫu nghi ngờ E sakazakii 37 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Hình dạng khuẩn lạc E sakazakii mơi trường Mac Conkey (A) XLD (B) Hình 2.2: Mức độ phát triển E sakazakii nhiệt độ khác Hình 2.3: Các phương pháp phát E sakazakii 15 Hình 2.4: Khuẩn lạc E sakazakii môi trường ESIA, DFI OK 18 Hình 3.1: Sơ đồ quy trình kiểm nghiệm E sakazakii 24 Hình 4.1: Mẫu sữa bột tăng sinh mơi trường ESE 28 Hình 4.2: Khuẩn lạc mơi trường VRBGA sau 24 ủ (A) sau 48 ủ (B) 29 Hình 4.3: Khuẩn lạc chủng gốc (A) mẫu (B) môi trường VRBGA 30 Hình 4.4: Hai dạng khuẩn lạc mơi trường TSA sau 24 ủ (A: Khuẩn lạc màu vàng nhạt, B: Khuẩn lạc màu vàng đậm) 31 Hình 4.5: Khuẩn lạc chủng gốc (A) mẫu (B) môi trường TSA 32 Hình 4.6: Hình dạng vi khuẩn E sakazakii gốc (A) vi khuẩn nghi ngờ E sakazakii phân lập từ mẫu sữa bột (B) viii 33 Chương MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Theo ước tính chuyên gia, thị trường sữa Việt Nam có tốc độ tăng trưởng cao, tốc độ tăng trưởng thị trường sữa bột 15 - 20% năm Việc sử dụng sữa bột thay nguồn sữa mẹ trở nên phổ biến đặc biệt người mẹ khơng có đủ sữa cho bú Một lượng lớn sữa bột thị trường sữa nhập từ bên Sau loạt cố vấn đề vệ sinh liên quan đến sản phẩm sữa, việc kiểm tra chất lượng sữa ngày quan tâm nhiều Ở nước phát triển cộng đồng Châu Âu, danh mục vi sinh cần kiểm tra sản phẩm sữa thức ăn dạng bột cho trẻ em, việc kiểm tra tiêu như: E coli, Salmonella, tổng số vi sinh vật hiếu khí Enterobacter sakazakii nằm danh mục vi sinh cần kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii vi khuẩn họ đường ruột E coli xa lạ với nhiều người Việt Nam Vi khuẩn gây nhiều bệnh nghiêm trọng như: viêm màng não, viêm đại tràng, nhiễm trùng máu, chết hoại ruột non … với tỉ lệ tử vong cao Sữa bột môi trường thuận lợi cho E sakazakii phát triển tồn sữa bột tới năm năm Khi sữa bột hồn ngun môi trường thuận lợi cho vi sinh phát triển gây bệnh cho trẻ sử dụng sữa, đặc biệt trẻ sinh thiếu tháng trẻ có trọng lượng sơ sinh thấp Tuy vi khuẩn nguy hiểm E sakazakii khơng có danh mục vi sinh cần kiểm tra y tế Việt Nam Hiện có nhiều phương pháp định danh E sakazakii sản phẩm sữa thị trường, phổ biến nuôi cấy truyền thống Đây phương pháp áp dụng nhiều quan kiểm nghiệm phòng thí nghiệm, để kiểm nghiệm hầu hết vi sinh vật chi phí kiểm nghiệm thấp, khơng đòi hỏi thiết bị, dụng cụ hóa chất mắc tiền Có nhiều phương pháp truyền thống định danh E sakazakii phát bỏ sót số khuẩn lạc có màu trắng, nhợt nhạt, khơng xác định rõ sắc tố dẫn tới kết âm tính giả Để nâng cao độ nhạy phương pháp, hướng nghiên cứu FDA tìm mơi trường chun biệt bổ sung thêm số chất kháng sinh vào môi trường tăng sinh phân lập để hạn chế phát triển vi sinh vật cạnh tranh (FDA, 2004) 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau tiến hành thí nghiệm đưa kết luận sau Trong tổng số 40 mẫu sữa bột kiểm tra theo phương pháp FDA phân lập Enterobacter sakazakii từ 10 mẫu sữa với tỉ lệ 25% Kết kiểm nghiệm cho thấy tỉ lệ nhiễm E sakazakii sản phẩm sữa bột Việt Nam cao (25%) so với nước khác (từ - 15%) Phương pháp FDA có cải tiến bước tăng sinh (thay môi trường EE ESE) cải thiện tính đồng mơi trường VRBGA phương pháp FDA không cải tiến 5.2 Đề nghị Do giới hạn thời gian kinh phí nên số lượng mẫu kiểm tra chưa nhiều, qui trình phân lập truyền thống nhiều hạn chế nên cần thực thêm nhiều thí nghiệm nhằm nâng cao độ xác kết Do mức độ nguy hiểm E sakazakii, kiến nghị nên tiến hành kiểm tra diện E sakazakii diện rộng để đưa vi khuẩn vào danh mục vi sinh cần kiểm tra góp phần bảo vệ sức khỏe lợi ích người tiêu dùng sản phẩm sữa nước tràn lan thị trường Thực so sánh kết với nhiều loại chủng gốc khác nhau, sử dụng hệ thống sinh hóa có độ xác cao sử dụng nhiều phòng thí nghiệm giới như: API 20E, API 32E để định danh xác vi khuẩn Tiến hành kiểm nghiệm theo phương pháp FDA có cải tiến kết hợp thêm môi trường tăng sinh chuyên biệt (như: DFI, ESIA) để định danh xác E sakazakii đồng thời thực thêm phương pháp sinh học phân tử để kiểm chứng lại kết kiểm nghiệm nâng cao độ nhạy độ xác kết 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Thị Viết Hiếu, 2008 Khảo sát Enterobacter sakazakii sữa bột trẻ em Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành chế biến bảo quản nông sản thực phẩm, đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Dương Ngọc Phương, 2008 Phát vi khuẩn Enterobacter sakazakii từ sữa bột thành phố Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành chế biến bảo quản nông sản thực phẩm, đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI Arseni A., Malamour - Ladas E., Koutsia C., Xanthou M., and Trikka E., 1987 Outbreak of colonization of neonates with Enterobacter sakazakii J Hosp Infect 9: 143 - 150 Arku B., Mullane N., Fox E., Fanning S., and Jordan K., 2008 Enterobacter sakazakii survives spray drying International Journal of Dairy Technology 61 (1): 102 - 108 Bar - Oz B., Preminger A., Peleg O., Block C., and Arad I., 2001 Enterobacter sakazakii infection in the newborn Acta Paediatr 90: 356 - 358 Bowen B.A., and Braden R.C., 2006 Invasive Enterobacter sakazakii disease in infants Emerging Infectious Diseases 12 (8): 1185 - 1189 Breeuwer P., Lardeau A., Peterz M., and Joosten H.M., 2003 Desiccation and heat tolerance of Enterobacter sakazakii Journal of Applied Microbiology 95:967 973 Caubilla - Barron J., Hurrell E., Townsend S., Cheetham P., Loc - Carrillo C., Fayet O., Prere M.F., and Forsythe S.J., 2007 Genotypic and phenotypic analysis of Enterobacter sakazakii strains from an outbreak resulting in fatalities in a neonatal intensive care unit in France Journal of Clinical Microbiology 45 (12): 3979 - 3985 CDC (Centers for Disease Control and Prevention), 2002 Enterobacter sakazakii infections associated with the use of powdered infant formula - Tennesse, 2001 MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report) 51 (14): 297 - 300 41 10 Drudy D., Mullane R.N., Quinn T., Wall P.G., and Fanning S., 2006 Enterobacter sakazakii: An emerging pathogen in powdered infant formula Food Safety 42: 996 - 1022 11 FAO/WHO (Food and agriculture Organization - World Health Organization), 2006 Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powdered infant formula Meeting Report Joint FAO/WHO Technical Meeting on Enterobacter sakazakii and Salmonella powdered infant formula, Rome, Italia 16 - 20/1/2006 [FAO/WHO] Microbiological Risk Assessment Series, No 10 12 Farmer J.J., Asbury M.A., Hickman F.W., Brenner D.J., and The Enterobacteriaceae Study Group, 1980 Enterobacter sakazakii: A new spices of “Enterobacteriaceae” isolated from clinical specimens International Journal of Systematic Bacteriology 30: 569 - 584 13 Farmer J.J., Davis B.R., and Hickman - Brenner, 1985 Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens J Clin Microbiol 21: 46 - 76 14 Fiore A., Casale M., and Aureli P., 2008 Enterobacter sakazakii: epidemiology, clinical presentation, prevention and control Ann Ist Super Sanita 44 (3):275 280 15 Forsythe J.S., 2005 Enterobacter sakazakii and other bacteria in powdered infant milk formula Maternal and Child Nutrition 1: 44 - 50 16 Gassem M.A.A., 1999 Study of the microorganisms associated with the fermented bread (khamir) produced from sorghum in Gizan region, Saudi Arabia Journal Applied Microbiology 86: 221 - 225 17 Guillaume - Gentil, O., Sonnard V., Kandhai M.C., Marugg J.D., J.D., and Joosten H., 2005 A simple and rapid cultural method for detection of Enterobacter sakazakii in environmental samples J Food Protect 68: 64 - 69 18 Gurtler B.J., Kornacki L.J., and Beuchat R.L, 2005 Enterobacter sakazakii: A coliform of increase concern to infant health International Journal of Food Microbiology 104: - 34 19 Gurtler B.J., and Beuchat R.L., 2005 Performance of media for recovering stressed cells of Enterobacter sakazakii as determined using spiral plating and ecometric techniques Applied and Environmental Microbiology 71 (12): 7661 - 7669 20 Heuvelink A.E., Kodde F.D., Zwartkruis - Nahuis J.T.M., and de Boer E., 2001 Enterobacter sakazakii in melkpoeder Keuringsdienst van Waren Oost Project number OT 0110 42 21 Iversen C., and Forsythe, 2003 Risk profile of Enterobacter sakazakii, an emergent pathogen associated with infant milk formula Trends in Food Science & Technology 14: 443 - 454 22 Iversen C., Lane M., and Forsythe S J., 2004 The growth profile, thermotolerance and biofilm formation of Enterobacter sakazakii grown in infant formula milk Letters in Applied Microbiology 38: 378 - 382 23 Iversen C., and Forsythe J.S., 2006 Comparison of media isolation of Enterobacter sakazakii Applied And Environmental Microbiology 73 (1): 48 - 52 24 Kandhai C.M., Reij W.M., Gorris G.M.L., Guillaume - Gentil O., and Schothorst M., 2004 Occurrence of Enterobacter sakazakii in food production environments and households The Lancet 363: 39 - 40 25 Kandhai C.M., Reij W.M., Grognou C., Schothorst M., Gorris G.M.L., and Zwietering H., 2006 Effects of preculturing conditions of lag time and specific growth rate of Enterobacter sakazakii in reconstituted powdered infant formula Appiled and Environmental Microbiology 72 (4): 2721 - 2729 26 Kang E.S., Nam Y.S., and Hong K.W., 2007 Rapid detection of Enterobacter sakazakii using Taqman real - time PCR asay J Microbiol Biotechnol 17 (3): 516 - 519 27 Kim H., Ryu Jee - Hoon and Beuchat R.L., 2006 Attachment of and biofilm formation by Enterobacter sakazakii on stainless steel and enteral feeding tubes Applied and Environmental Microbiology 72 (9): 5846 - 5856 28 Kim Soo - Hwan and Park Jong - Hyun, 2007 Thermal resistance and inactivation of Enterobacter sakazakii isolates during rehydration of powder infant formula J Microbiol., Biotechnol 17 (2): 364 - 368 29 Kim H., Ryu Jee - Hoon, and Beuchat R.L., 2007 Effectiness of disinfectants in killing Enterobacter sakazakii in suspension, dried on the surface of stainless steel, and in a biofilm Appiled and Environmental Microbiology 73 (4): 1256 1265 30 Kline M.W.,1988 Pathogenesis of brain abscesses caused by Citrobacter diversus or Enterobacter sakazakii The Pediatric Infectious Disease Journal 7: 891 892 31 Lai K.K., 2001 Enterobacter sakazakii infections among neonates infants, children and adults Medicine 80: 113 - 122 43 32 Lehner A.J., Tarasa T., and Stephan R., 2004 16S rRNA gene based analysis of Enterobacter sakazakii strains from different sources and development of a PCR assay for identification BMC Microbiology (1): 43 - 49 33 Mange J.P., Stephan R., Borel N., Wild P., Kim K.S., Pospischil A., and Lehner A., 2006 Adhesive properties of Enterobacter sakazakii to human epithelial and brain microvascular endothelial cells BMC Microbiol 6: 58 34 Mossel, D.A.A., Mengerink, W.H.J, and Scholts H.H., 1962 Use of modified MacConkey agar medium for selective growth and enumeration of Enterobacteriaceae J Bacteriol 84: 381 35 Mullane N.R., Murray J., Drudy D., Prentice N., Whyte P., Wall P.G., Parton A.,and Fanning S., 2006 Detection of Enterobacter sakazakii in dried infant milk formular by cationic - magnetic - bead capture Applied and Environmental Microbiology 72 (9): 6325 - 6330 36 Mullane N.R., Whyte P., Wall P.G., Quinn T., and Fanning S., 2007 Application of pulsed-field gel electrophoresis to characterise and trace the prevalence of Enterobacter sakazakii in an infant formula processing facility International Journal of Food Microbiology 116: 73 - 81 37 Mullane N.R., Healy B., Meade J., Whyte P., Wall P.G., and Fanning S., 2008 Dissemination of Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii) in a powdered milk protein manufacturing facility Appiled and Environmental Microbiology 74 (19): 5913 - 5917 38 Muytjens C.H., Zanen C.H., Soderkamp J.H., Kollee A.L., Wachsmuth K.I., and Farmer J.J., 1983 Analysis of eight cases of neonatals meningitis and sepsis due to Enterobacter sakazakii Journal of Applied Microbiology 18 (1): 115 - 120 39 Muytjens L.H., Roeslofs - Willemse H., and Jaspar H.J.G., 1988 Quality of powdered subtitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae Journal Clinical Microbiology 26 (4): 743 - 746 40 Nair M.K.M., and Venkitanarayanan S.K., 2006 Cloning and sequencing of the ompA gene of Enterobacter sakazakii and development of an ompA - targeted PCR for rapid detection of Enterobacter sakazakii in infant formula Applied and Evironmental Microbiology 72 (4): 2539 - 2546 41 Nazarowec - White M., and Farber J M., 1997 Thermal resistance of Enterobacter sakazakii in reconstituted dried - infant formula Letters in Apllied Microbiology 24: - 13 44 42 Oh Se - Wook and Kang Dong-Hyun, 2004 Fluorogenic selective and differential medium for isolation of Enterobacter sakazakii Applied and Environmental Microbiology 70 (9): 5692 - 5694 43 Oxoid, 2007 Product list - 42 44 Pagotto F.J., Nazarowec - White M., Bidawid A., and Farner J.M., 2003 Enterobacter sakazakii: infectivity and enterotoxin production in vitro and in vivo J Food Prot 66: 370 - 375 45 Ray P., Gautam V., Jain N., Narang A., and Sharma M., 2007 Enterobacter sakazakii in infants: novel phenomenon in India Indian J of Med Microbiol 25 (4): 408 - 410 46 Ryu J.H., and Beuchat L.R., 2005 Biofilm formation by Escherichia Coli O157:H7 on stainless steel: effect of exopolysaccharide and curli production on its resistance to chlorine Applied and Environmental Microbiology 71: 247 - 254 47 Shaker R.R., Osaili T., Al - Omary W., Jaradat Z., and Al - Zuby M., 2007 Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacter sp from food and food production environments Food Control 18: 1241 - 1245 48 Shaker R.R., Osaili T.M., Al - Hasan Abu A.S., Ayyash M.M., and Forsythe S.J., 2008 Effect of desiccation, starvation, heat and cold stress on the thermal resistance of Enterobacter sakazakii in rehydrated infant milk formula Journal Of Science 73 (7): 354 - 359 49 Simmons B.P., Gelfand M.S., Haas M., Metts L., and Ferguson J., 1989 Enterobacter sakazakii infections in neonates associated with intrinsic contamination of a powdered infant formula Inf Cont Hosp Epidemiol 10: 398 - 401 50 Song, Kwang - Young, Hyeon Ji-Yeon, Shin Ho-Chul, Park Chan-Kyu, Choi In Soo, and Seo Kun - Ho, 2008 Evaluation of chromogenic medium supplemented with glucose for detecting Enterobacter sakazakii J Microbiol Biotechnol 18 (3): 579 - 584 51 Stephan R., Trappen S., Cleenwerck I., Iversen C., Joosten H., Paul De Vos, and Lehner A., 2008 Enterobacter pulveris sp Nov., isolated from fruit powder, infant formula and an infant formulaproduction environment International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58: 237 - 241 52 Townsend S., Hurrel E and Forsythe S., 2008 Virulence studies of Enterobacter sakazakii isolates associated with a neonatal intensive care unit outbreak BMC Microbiology 64 (8): 56 - 64 45 53 Urmenyi A.M.C., and Franklin A.W., 1961 Neonatal death from pigmented coliform infection The Lancet i: 313-315 54 Zuber S., Boissin - Delaporte C., Michot L., Iversen C., Diep B., Brussow H., and Breeuwer P., 2008 Decreasing Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) food contamination level with bacteriophages: prospects and problems Microbial Biotechnology (6): 532-543 TÀI LIỆU INTERNET 55 FAO/WHO (Food and agriculture Organization - World Health Organization), 2004 Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powdered infant formula Meeting Report MRA series World Health Organization, Geneva, Switzerland Mr Greg Paoli and Dr Emma Hartnett Truy cập ngày 20/06/2009 http://www.who.int/foodsafety/publications/micro/mra6/en 56 FAO/WHO (Food and agriculture Organization – World Health Organization), 2006 Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powdered infant formula Meeting Report MRA series 10 World Health Organization, Geneva, Switzerland Truy cập ngày 05/05/2009 http://www.who.int/foodsafety/publications/micro/mra10/en/index.html 57 FDA/CFSAN (U.S Food and Drug Administration Center for Food Safety and Applied Nutrition), 2002 Isolation and enumeration of Enterobacter sakazakii from dehydrated powdered infant formula Truy cập ngày 15 tháng năm 2009 http://www.cfsan.fda.gov/%7Ecomm/mmesakaz.html 46 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường Buffer peptone water (BPW) Peptone 10,0 g NaCl 5,0 g Na2HPO4.10H2O 9g KH2PO4 1,5 g Nước 1000 ml Enterobacter sakazakii enrichment (ESE) Natri hydrogen phosphate 6,5 g Kali dihydrogen phosphate 2,0 g Chiết xuất nấm men 1,5 g Peptone trung tính 4,0 g Base tryptone 12 g NaCl 4,0 g Sucrose 100,0 g Natri deoxycholate 0,5 g Nước 1000 ml pH: ± 0,1 (Iversen ctv, 2006) Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA) Peptone từ thịt 7,0 g Chiết xuất nấm men 3,0 g NaCl 5,0 g Lactose 10 g Glucose 10 g Neutral red 0,03 g Muối mật 1,5 g 47 Crystal violet 0,002 g Agar 13 g Nước 1000 ml Tryticase Soy Agar (TSA) Peptone từ casein 15,0 g Peptone từ đậu nành 5,0 g NaCl 5,0 g Agar 15 g Nước 1000 ml Nutrient agar (NA) Chiết xuất thịt 10 g Peptone 10 g NaCl 5g Agar 15 g Nước 1000 ml Phenol red broth base Peptone từ casein 5g Peptone từ thịt 5g NaCl 5g Phenol red 0,018g Nước 1000 ml 48 Phụ lục 2: Danh mục vi sinh cần kiểm tra (2007) sản phẩm khô dạng bột dành cho trẻ em Codex Alimentarius EC (quy định EC số 1441/2007, ngày tháng 12 năm 2007) Kích thước mẫu n c m M Tổng vi khuẩn hiếu khí 103 104 Coliform 6 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 04/12/2009 4/12/2010 Sữa bột nguyên kem Hà Lan Bịch nhơm 500gr >6 tuổi Chợ Hòa Hưng, Q10 26/03/2009 26/03/2010 Sữa bột béo Hòa Lan Bịch nhựa 500gr >3 tuổi Chợ Tân Kiểng, Q7 03/01/2009 03/01/2010 Sữa bột béo Hà Lan Bịch nhựa 500gr >2 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 26/11/2008 26/11/2009 Sữa Úc Gold Pro Bịch nhôm 500gr >3 tuổi Chợ Củ Chi, huyện Củ Chi 12/05/2008 12/05/2009 Sữa bột béo Bịch nhựa 500gr tháng tới tuổi Chợ Bình Tây, Q6 04/01/2009 04/01/2010 Sữa bột Hà & Lan Bịch nhựa 450gr >3 tuổi Chợ Phạm Thế Hiển, Q8 18/07/2008 18/07/2009 Sữa bột nguyên kem giàu canxi Bịch nhôm 500gr >6 tuổi Chợ Rạch Ông, Q8 23/02/2009 23/02/2010 Sữa bột dinh dưỡng Bịch nhựa 500gr >3 tuổi Phố sữa Nguyễn Thông, Q3 20/06/2008 20/06/2009 10 Sữa Mĩ Intellac Bịch nhôm 500gr >2 tuổi Chợ Bình Tây 12/04/2008 12/04/2009 11 Sữa bột nguyên kem Dollac Bịch nhôm 400gr >6 tuổi Chợ Thủ Đức, Q Thủ Đức 23/12/2008 23/12/2009 12 Sữa bột Smart – Gold Hộp giấy 400gr 3 tuổi Chợ Phạm Văn Hai, Q Tân Bình 04/07/2009 04/07/2010 15 Sữa bột nguyên kem tan nhanh Bịch nhôm 500gr >6 tuổi Chợ Bàu Cát, Q Tân Bình 02/08/2009 02/08/2010 16 Sữa bột nguyên kem béo lạt Bịch nhôm 400gr >2 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 02/09/2009 02/09/2010 17 Sữa bột dinh dưỡng tiên tiến Hộp giấy 400gr 2 tuổi Chợ Nhật Tảo, Q10 25/03/2009 25/03/2010 19 Sữa bột cân kí Bịch 1kg Khơng Chợ Cầu Muối, Q1 Không Không 20 Sữa bột nguyên kem Intellac Bịch nhôm 500gr >6 tuổi Chợ Tân Định, Q1 29/05/2008 29/05/2009 51 Danh sách sữa kiểm nghiệm (tiếp theo) Stt Nhãn hiệu Dạng đóng gói Độ tuổi sử dụng Nơi mua Ngày sản xuất Hạn sử dụng 21 Sữa bột nguyên kem Bịch nhựa 500gr >2 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 21/04/2009 21/04/2010 22 Sữa bột cân kí Bao 50 kg Khơng Chợ Bà Chiểu, Q Bình Thạnh Khơng Khơng 23 Sữa bột cân kí Bịch 500gr Khơng Chợ Thị Nghè, Q Bình Thạnh Khơng Khơng 24 Sữa bột nguyên kem Bịch nhựa 500gr >1 tuổi Phố sữa Nguyễn Thông, Q3 23/10/2008 23/10/2010 25 Sữa bột nguyên kem Hòa Lan Bịch nhựa 500gr >6 tháng tuổi Chợ An Khánh, Q2 26/11/2008 26/11/2009 26 Sữa bột không béo bổ sung canxi Bịch nhôm 400gr tháng tới tuổi Chợ Thanh Đa, Q Bình Thạnh 02/09/2008 02/09/2009 27 Sữa bột phát triển toàn diện Hộp giấy 400gr 2 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 20/02/2009 20/02/2010 29 Sữa bột nguyên kem uống liền Bịch nhôm 400gr >1 tuổi Phố sữa Nguyễn Thông 26/04/2009 26/04/2011 30 Sữa bột trẻ em Hộp 500gr >3 tuổi Chợ Phạm Thế Hiển, Q8 20/04/2009 20/04/2010 31 Sữa bột nguyên kem Hộp thiếc 330gr >2 tuổi Siêu thị Coopmart, Q10 21/11/2008 21/11/2009 32 Sữa bột nguyên kem Hộp thiếc 400gr >6 tuổi Chợ Hòa Hưng, Q10 13/01/2009 13/01/2010 33 Sữa bột nguyên kem Bịch nhựa 500gr tháng tới tuổi Siêu thị Big C, Q10 12/4/2008 12/04/2010 34 Sữa bột nguyên kem Bao 50 kg >2 tuổi Chợ Phạm Văn Hai, Q Tân Bình Khơng Khơng 35 Sữa bột béo Hộp giấy 450gr 6 tuổi Chợ Bình Tây, Q6 04/01/2009 04/06/2010 37 Sữa bột nguyên kem uống liền Hộp giấy 450gr >3 tuổi Siêu thị Big C, Q10 26/12/2008 26/12/2009 38 Sữa bột béo tan nhanh Bịch nhựa 500gr >6 tháng tuổi Siêu thị Coopmart, Q10 03/06/2008 03/12/2009 39 Sữa bột béo Hộp thiếc 500gr >2 tuổi Chợ Phú Lâm, Q6 25/04/2009 25/04/2010 40 Sữa bột tăng trưởng chiều cao Hộp giấy 450gr >6 tuổi Chợ Thủ Đức, Q Thủ Đức 08/03/2009 08/03/2010 52 Phụ lục 5: Kết thử Bis 14 gene 10 mẫu nghi ngờ E sakazakii Mẫu Bis 14gen Chủng gốc Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 16 Mẫu 23 Mẫu 25 Mẫu 27 Mẫu 28 Mẫu 30 Mẫu 34 Oxidase - - - - - - - - - - - Glucose + + + + + + + + + + + Nitrate + + + + + + + + + + + ONPG + + + + + + + + + + + Urease - - - - - - - - - - - PAD - - - - - - - - - - - Citrate + + - + + + + + + + + Esculin + + + + + + + + + + + H2S - - - - - - - - - - - Indol - - - - - - - - - - - VP + + + + + + + - + - + Malonate - - - - - - - - - - - LDC - - - - - - - - - - - Di động + + + + + + + + + + + 53 ... decarboxylase - - + - + Arginine dihydrolase + + - - - Ornithine decarboxylase + + + - + KCN + + + v - Sucrose + + + (+) + Dulcitol - (-) - (-) - Adonitol - (-) + - - Raffinose + + + v + D-sorbitol - +... - + + v - + (+) - - - - (-) + - + + - - (+) - Khả lên men loại đường x-methyl-Dglucosidase D-arabinose Sinh sắc tố vàng (Farmer Kelly, 1992 Trích dẫn FDA/CFSAN, 2002) Ghi chú: +: 90 - 100% dương... Chromogenic Enterobacter sakazakii) sử dụng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α,D-glucopyranoside (XαGlc) chất sinh màu để phân biệt E sakazakii Enzyme α-glucosidase E sakazakii thủy phân chất XαGlc