2.4.1. Mơ tả nội dung:
Đối tƣợng nghiên cứu: , , cyclohexan đạt tiêu chuẩn phân tích, than hoạt tính ShizasagiZ1 (Nhật).
Quy mơ thực hiện: Quy trình tinh chế đạt hiệu suất cao và sản xuất β- CD tinh chế đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng
Thời gian thực hiện: 07/2011 – 09/2011
Địa điểm thực hiện: Phịng Thí Nghiệm Vi Sinh Cơng Nghệ, Bộ mơn Vi – Ký sinh, Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Tp.HCM
2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Từ các thơng số tối ƣu khảo sát đƣợc trong các thí nghiệm ở mục 2.2 và 2.3, tiến hành sản xuất thử nghiệm β-CD và xây dựng quy trình tinh chế β- quy trình sản xuất thử nghiệm
do. [5, 6, 57]
Giai đoạn 1: Dịch hĩa, cắt mạch tinh bột
Cho tinh bột vào nƣớc khuấy đều, đun ở nhiệt độ 90oC khoảng 15 phút để hồ hĩa, làm nguội.
Cho enzym CGTase vào 2.3, khuấy đều
khoảng 1 giờ, dƣới sự tác động của enzym thì gel tinh bột hĩa thành dạng lỏng. nzym CGTa
2.
Bổ sung Streptomycin sulfat nồng độ 35 µg/ml nhằm ức chế vi khuẩn từ mơi trƣờng trong quá trình thực hiện vịng hĩa.
Điều chỉnh pH về 7 để tạo điều kiện thích hợp cho enzym hoạt động.
Cho dung mơi cyclohexan vào để chuyển dịch cân bằng phản ứng tạo ra β–CD mà khơng phải tạo ra các cyclodextrin vịng khác hay các dextrin thẳng.
Lắc hỗn hợp với tốc độ 61 .
Giai đoạn 3 : Thu dịch sản phẩm β-CD
Hỗn hợp sau phản ứng tiếp tục đƣợc đem đi tách và tinh chế thu β–CD. Sau khi sản xuất β-CD theo quy trình trên, chúng ta tiến hành tách
ra khỏi hỗn hợp phản ứng bằng cách lọc, và để sử dụng cho chu kỳ sản xuất tiếp theo , ly tâm 9600 vịng/phút trong 30 phút ở 4oC để tách sản phẩm dung mơi ra khỏi dung dịch phản ứng
. Sau ly tâm lạnh, thu phần cắn hịa lại với
1/5 . Hỗn hợp đem chƣng cất lơi cuốn theo hơi nƣớc. Dƣới tác dụng của nhiệt độ cao phức vùi của dung mơi với β–CD bị tách ra và dung mơi bay ra ngồi cùng với hơi nƣớc.
2.4.2.1. Nghiên cứu làm sạch sơ bộ dịch cyclodextrin bằng than hoạt tính Z1
Hỗn hợp sau cất chứa nhiều tạp chất và cĩ màu trắng ngà, hơi đục do cịn lẫn các dextrin. Để cĩ thể tách cyclodextrin và các dextrin phân tử lƣợng cao, tiến hành lọc dung dịch bằng than hoạt tính ở các nồng độ than hoạt tính khác nhau (% than hoạt/lƣợng tinh bột sử dụng) nhằm làm sạch các tạp chất cơ học đồng thời loại bỏ hiện tƣợng sẫm màu của dung dịch.
ở 80oC trong 30 phút. Màu sắc của dịch đƣợc xác định bằng cảm quan và đo độ hấp thu ở bƣớc sĩng 230 nm.
.
2.4.2.2. -
-
Dung dịch 15% β-CD đƣợc chuẩn bị khuấy 70oC 60oC, thêm 5% cyclohexan vào (tt/tt), để trong vịng 4 giờ β- CD tạo phức vùi với cyclohexan.
Phức vùi β-CD-cyclohexan đƣợc lọc nĩng bằng chân khơng, .
10 - -
80oC,
β-CD- .
β-CD. Để dung dịch đến nhiệt độ phịng chờ kết tinh. Tinh thể sau kết tinh đƣợc sấy khơ.
2.4.2.3. Xác định β-CD β-CD tinh (β- 1,85 g/100 ml ở 25o C) : β- β-CD. a. β-CD
Thời gian là một yếu tố quan trọng trong quá trình kết tinh -CD. Do đĩ chúng tơi tiến hành xác định thời gian thích hợp cho quá trình kết tinh nhằm đạt hiệu quả cao
nhất 12, 24, 48 β-cyclodextrin 10
25oC. Tinh thể -CD đƣợc tách ra khỏi dung dịch bằng cách ly tâm trong thời gian 15 phút với tốc độ 3000 vịng/phút, sau đĩ sấy khơ ở nhiệt độ 60o
C. Sản phẩm thu
đƣợc β–CD theo phƣơng pháp Kaneko. [5, 24, 32]
- ể kết tinh β-CD
β- . Tuy
nhiên nếu nồng độ β-CD quá cao, dịch đặc sẽ cản trở lại quá trình kế
β-CD l 4%, 6%, 8%, 10%
khỏi dung dịch bằng cách ly tâm trong thời gian 15 phút với tốc độ 3000 vịng/phút, sau đĩ sấy khơ ở nhiệt độ 60oC. Sản phẩm thu đƣợc
β–CD theo phƣơng pháp Kaneko.
2.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi
Thực hiện sản xuất thử nghiệm, tiến hành quá trình tách và thu nhận sản phẩm nhƣ trên. Kiểm sốt các thơng số của quá trình sản xuất:
-Xác định khối lƣợng sản phẩm tạo thành
-Định lƣợng nồng độ β–CD trong sản phẩm cuối thu đƣợc.
Từ các thơng số của quá trình tách và tinh chế sản phẩm, kiểm sốt quy trình để đạt hiệu suất tạo thành β-CD cao hơn.
2.4.4. Sản phẩm nội dung cần đạt
- Quy trình tách và tinh chế đạt hiệu suất cao.
- Sản phẩm β- CD sau tinh chế đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng (nồng độ β–CD trong sản phẩm cuối đạt 98%).