2.1.2.1.
a. Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford Nguyên tắc
- . Thuốc thử này tồn
tại ở ba dạng: cation (màu nâu đỏ), trung tính (màu xanh lá), anion (màu xanh dƣơng). Trong mơi trƣờng acid, thuốc thử dạng cation màu nâu đỏ hấp thu cực đại ở bƣớc sĩng 465 nm, khi liên kết với protein tạo phức hợp màu xanh cĩ sự dịch chuyển bƣớc sĩng hấp thu cực đại lên 595 nm. [30, 39]
Xây dựng đường chuẩn protein
Pha dung dịch bovine serum albumin (BSA) 0,1 mg/ theo bảng sau:
Bảng 2.1. Giai mẫu protein cho đƣờng chuẩn Ống thử 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 BSA 0,1 mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Nƣớc cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 . Cho tiếp 1ml thuốc thử Bradford vào, lắc đều và để ổn định màu trong 5 phút. Đo độ hấp thu của dung dịch ở bƣớc sĩng 595 nm (ODx). Mẫu đối chứng là nƣớc cất (ODo). Lấy giá trị ∆OD = ODx - ODo. Vẽ đƣờng tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) và mật độ quang ∆OD595.
protein
Độ hấp thu sẽ tỉ lệ với lƣợng protein ở một khoảng giá trị nhất định. Lƣợng protein trong mẫu đƣợc xác định dựa trên đƣờng chuẩn đã đƣợc thiết lập. Từ giá trị ∆OD đo đƣợc của mẫu suy ra trị số tƣơng ứng trên trục hồnh, đĩ chính là nồng độ protein (µg/ml) của mẫu trong dung dịch đo.
. Từ nồng độ protein tính đƣợc trong dịch đo, suy ra tổng lƣợng protein cĩ trong nguyên liệu ban đầu.
b.
Nguyên tắc
từ maltodextrin trong điều kiện thí nghiệm nhất định.
Trong mơi trƣờng pH < 8,5 phenolphtalein tồn tại ở dạng lacton khơng màu, cịn trong mơi trƣờng pH > 9, phenophtalein tồn tại ở dạng dianion cĩ màu hồng. Khi cĩ mặt β-CD, nĩ sẽ tạo phức hợp phức vùi với β-CD nhờ lực Van der Vaals, đồng thời làm giảm cƣờng độ màu của dung dịch phenolphtalein (pH > 9). Tƣơng tác liên phân tử làm phân tử phenolphtalein xoắn nhiều hơn trên nguyên tử carbon trung tâm, dẫn đến giảm cƣờng độ màu. Do đĩ lƣợng β-CD do CGTase tạo ra cĩ thể xác định dựa trên mức độ giảm cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch phenolphtalein (pH
> 9). Đo độ hấp thu ở bƣớc sĩng 550 nm vì phenolphtalein dianion hấp thu cực đại ở bƣớc sĩng này. [17, 53, 59]
Hoạt tính của enzym đƣợc định nghĩa là số µmol β-CD đƣợc tạo ra trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.
Hĩa chất:
Phenolphtalein 0,02% trong đệm Na2CO3/ NaHCO3 125 mM pH 10,5.
Xây dựng đường chuẩn định lượng β-CD:
Pha dung dịch β-CD 1%: cân chính xác khoảng 1g β-CD, cho vào bình định mức 100ml, thêm nƣớc cất đến vạch. Từ dung dịch trên pha thành giai mẫu theo bảng sau:
Bảng 2.2. Giai mẫu xây dựng đƣờng chuẩn.
Ống thử 1 2 3 4 5 6
Nồng độ β-CD (µg/ 100 µl) 0 100 200 300 400 500
β-CD 1% (ml) 0 1 2 3 4 5
Nƣớc cất (ml) 0 9 8 7 6 5
β- 6 ống nghiệm mới.
Sau đĩ cho lần lƣợt vào mỗi ống nghiệm: 3,5 ml NaOH 30 mM; 0,9 ml maltodextrin 4%; 0,5 ml phenolphtalein 0,02%. Để ổn định màu trong 15 phút, sau đĩ đo độ hấp thu ở bƣớc sĩng 550 nm. Vẽ đƣờng tuyến tính giữa nồng độ β-CD (µg/100 µl) và mật độ quang ∆OD550.
i. Xác định hoạt tính enzym tự do
550 nm.
Bảng 2.3. Cách pha mẫu để xác định hoạt tính enzym
Mẫu thử Mẫu chứng Mẫu trắng
Enzym (ml) 0,1 0,1 0 NaOH 30 mM (ml) 0 3,5 3,5 Maltodextrin 4% (ml) 0,9 0,9 0,9 Nƣớc cất (ml) 0 0 0,1 Ủ ở 60 0C trong 10 phút NaOH 30 mM (ml) 3,5 0 0 Phenolphtalein 0,02% (ml) 0,5 0,5 0,5
Tính hiệu số độ hấp thu của mẫu chứng và mẫu thử: ∆OD = OD chứng – OD thử
β-CD suy ra số µg β-CD đƣợc tạo ra do CGTase.
Hoạt tính CGTase trong mỗi ml dung dịch CGTase đƣợc tính theo cơng thức: ∆OD x 10 x n
a x M x t
A = (U/ ml)
Với: n : hệ số pha lỗng
a : hệ số gĩc của đƣờng chuẩn nồng độ β-CD theo độ hấp thu t : thời gian phản ứng (10 phút)
M : khối lƣợng riêng của β-CD (M = 1135) 10 : tỉ lệ ezym phản ứng (1ml/0,1ml = 10) ii. đã cố định enzym 10 . . (A’) : ∆OD x 10 x m a x 1,135 x b A’ = (U/ mg) a : β- CD b : (g) 10 : m : (g) : Hàm lƣợng CGTase cố định Hoạt tính CGTase cố định A” = (U/ mg) 2.1.2.2. nhau nhƣ Al2O3 - sau khi .
: d - hệ đ - - . : thời g 2, 6, 12, đã khảo sát ở trên : trên. : khi . hƣ
với dung dịch đệm. Tiếp tục cho phản ứng xác định hoạt tính lần 2, lần 3, lần 4…
.
2.1.2.2.1. lên Al2O3
- Hydrat hĩa Al2O3: 10 Al2O3 đƣợc đun nĩng với 100 ml acid nitric lỗng HNO3:H2O là 1:20) ở 82oC trong 1 giờ. Sau đĩ, rửa Al2O3 với nƣớc cất trên phễu Büchner đến khi dịch lọc trung tính. Hút chân khơng Al2O3 trong 15 phút và sấy Al2O3 đã hoạt hĩa ở 105oC trong vịng 24 giờ.
- Cố định CGTase trên Al2O3: Hút chân khơng Al2O3 đã hydrat hĩa 15 phút. Cho CGTase Al2O3. Khuấy ở 30oC trong 24 giờ. Lọc Al2O3 đã cố định CGTase trên phễu Büchner, rửa đến hết protein với nƣớc cất. Dịch lọc đƣợc giữ lại để xác định lƣợng CGTase gắn trên Al2O3 theo phƣơng pháp Bradford, Al2O3 đã cố định CGTase
làm khơ ở áp suất chân khơng trong 20 phút và trữ ở 4oC. [46] Dung dịch đệm phosphate 0.001M Áp suất chân khơng Lọc Dịch rửa CGTase cố định trên Al2O3 Xác định cgtase khơng đƣợc cố định Làm khơ Bảo quản 4 0C 24h HNO3 lỗng 1g Al2O3 Khuấy mạnh 82 0 C 1h Lọc rửa đến trung tính Sấy 105 0 C 15h Al2O3 đã hoạt hĩa Hút chân khơng CGTase 15’ Lắc
24h HNO3 lỗng Al2O3 Khuấy mạnh 82 o C 1h Lọc rửa đến trung tính Sấy 105 o C 15h Al2O3 đã hoạt hĩa Hút chân khơng CGTase 15’ Lắc Dung dịch đệm phosphate 0.001M Lọc Dịch rửa CGTase cố định trên Al2O3 Xác định CGTase khơng đƣợc cố định Làm khơ Bảo quản P chân khơng 4oC
Hình 2.1. Quy trình cố định CGTase trên Al2O3
2.1.2.3. Cố định CGTase trên Q-Sepharose
Chuẩn bị: hút Q-Sepharose vào ống nghiệm, rửa nhiều lần với đệm Tris-HCl 50 mM pH 7; Thêm enzym CGTase pha trong đệm Tris-HCl pH 7 o
/enzym (ml/ml) l 3:1.
Cố định CGTase: cho CGTase vào Q-Sepharose lắc trong 6 giờ ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ để yên cho Q-Sepharose lắng xuống, hút dịch ra và tiếp tục rửa Q-Sepharose bằng đệm cho đến khi hết CGTase thơi ra. Thu dịch rửa xác định lƣợng CGTase đã cố
Đệm Tris- HCl 50 mM Đệm Tris- HCl 50 mM Dịch rửa CGTase/Q- Sepharose Xác định CGTase khơng đƣợc cố định Sepharose Rửa Lắc CGTase 30oC 6h Rửa Bảo quản 4oC
Hình 2.2. Quy trình cố định CG Tase lên Q-Sepharose
2.1.2.4. Cố định CGTase trên Purolite A100
Hoạt hĩa Puro 0,5 N và NaOH 0,5 N. Rửa lại với đệm
Tris- 30 phút.
Cho CGTase vào erlen chứa Purolite A100, lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ lọc qua phễu Büchner, rửa cho đến hết protein với nƣớc cất. Thu dịch rửa để xác định lƣợng enzym khơng cố định. CGTase cố đị 20 phút, bảo quản ở 4o C. [27] Đệm Tris HCl 50 mM CGTase/Purolite A100 Dich lọc Lọc Xác định CGTase khơng cố định Bảo quản 4oC Purolite A100 Lắc Rửa 150 rpm to phịng NaOH 0,5 N CGTase HCl 0,5 N Nƣớc cất
2.1.2.5. Cố định CGTase
Nam; Eupergit C N,N-methylen-bis-(methacrylamid), glycidyl
methacrylat, allyl g )
[26].
, do glutaraldehyd cĩ hai nhĩm -CHO: một gắn với enzym, một gắn với ch
/enzym. tơi
.
(kl/tt):
hoạt hĩa glutaraldehyd
nhau 1%, 2 %, 3%, đã hoạt hĩa đĩ để cố định
enzym (p 100 30 ml)
.
Ảnh hưởng của pH:
đƣợc hoạt hĩa bằng glutaraldehyd và enzym pha lỗng trong đệm
phosphat 100 mM pH 6, 7, 8 .
/ enzym:
.
2.1.2.5.1.
Tạo hạt chitosan từ chitosan thơ ban đầu
Cho 2 g chitosan vào becher cĩ chứa 100 ml acid acetic 2% (kl/kl), khuấy đều trên bếp từ trong 3 tiếng. Để ổn định ở 4o
.
Dùng 100 ml dung dịch NaOH 1M chứa
5% methanol (kl/kl) trên máy khuấy từ.
Để ổn định khoảng một giờ, sau đĩ lọc, rửa sạch NaOH trên phễu Büchner. Sấy ở 60oC trong 24 giờ. Sau đĩ nghiền mịn chitosan rồi cho qua rây 2 mm. [20, 21, 23, 46]
Hoạt hĩa chitosan
P 25% (kl/tt) 100
.
Cân chính xác khoảng 4 g chitosan cho vào erlen cĩ chứa 100ml dung dịch glutaraldehyd, khuấy đều trên bếp từ trong 24 giờ 25o
C.
0,01. Làm khơ trong chân khơng 30 phút.
Cố định enzym trên chitosan hoạt hĩa
Cho chitosan đã hoạt hĩa vào erlen cĩ chứa enzym CGTase pha trong đệm. Khuấy nhẹ ở 30o
C trong 2 . Lọc rửa sạch protein trên phễu Büchner, dịch rửa đƣợc dùng định lƣợng protein khơng cố định đƣợc.
ên chitosan đƣợc làm khơ dƣới áp suất chân khơng trong 20 phút, bảo quản ở 4oC.
4oC Bảo quản Chitosan dạng hạt
CGTase cố định trên chitosan Dich lọc Lọc
Làm khơ
Xác định CGTase khơng cố định Chitosan đã hoạt hĩa
Khuấy 25oC 24h
Áp suất chân khơng 30 phút Khuấy 30oC 2 h Lọc Gluteraldehyd CGTase Nƣớc cất
Hình 2.4. Quy trình cố định CGTase trên chitosan
2.1.2.5.2.Cố định trên EupergitC
Hoạt hĩa Eupergit C: ngâm 10g Eupergit C trong 200 ml 1,2-diaminoethane 1M 4h ở 60oC (pH 10), sau đĩ cho vào hỗn hợp glutaraldehyd 2,5% pH 8 (chỉnh bằng đệm phosphate 100 mM), khuấy từ ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ.
Rửa chất mang nhiều lần với nƣớc và đệm phosphat.
EuC đã hoạt hĩa sau đĩ đƣợc lắc với dung dịch CGTase (1 ml CGTase/1 g chất mang) trong đệm phosphat 100mM ở 25o
C, lắc 150 vịng/phút . Lọc và rửa hỗn hợp 3 lần với đệm phosphat 100 mM.
Làm khơ chân khơng chất mang thu đƣợc 20 phút và trữ ở 4o
C. [35]
2.1.2.6. Cố định CGTase
Calcium alginat đƣợc hình thành từ phản ứng giữa sodium alginat với ion Ca2+
. Phản ứng xảy ra nhƣ sau: 2Na(alginat) + Ca2+ → Ca(alginat)2 + 2Na+
Calcium alginat là một hệ thống mạng lƣới và chính hệ thống này là yếu tố cơ bản để cố định enzym.
Tiến hành
- 7.
-HCl 50 mM pH 7, hịa tan trên bếp từ cĩ gia nhiệt nhẹ. Thêm CGTase vào dung dich alginat, khuấy đều, loại bọt khí.
Dùng bơm nhu động nhỏ hỗn hợp trên vào dung dịch CaCl2
, s 2 -
. Sau khi nhỏ xong, để ổn định khoảng 1 giờ cho việc trao đổi ion Ca2+ xảy ra hồn tồn. Lọc hạt qua phễu Büchner, rửa cho hết protein với nƣớc cất. Dịch lọc thu lại dùng xác định hiệu suất cố định protein theo phƣơng pháp Bradford.
4oC. [4, 16, 29]
Enzym cố định lên alginat theo phƣơng pháp bắt giữ do vậy pH khơng ảnh hƣởng nhiều đến khả năng cố định của enzym lên chất mang. Trong khi đĩ nồng độ CaCl2 và nồng độ alginat ảnh hƣởng trực tiếp đến cấu trúc hạt gel, cũng nhƣ khả năng bắt giữ enzym và sự khuếch tán của cơ chất vào gel và sản phẩm ra khỏi gel, do vậy chúng tơi khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ CaCl2, nồng độ alginat và tỉ lệ enzym chất mang đến việc cố định lên alginat.
2:
cố định i dung 3% (kl/tt)
200 U/10 ml alginate trong dung dịch CaCl2 nồng độ 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M.
:
dung 2%, 3%, 4% (kl/tt)
- / enzym:
t mang/enzym (ml/ml) lần lƣợt là 200, 400, 600, 800U/10ml alginat với các thơng số 2
đã đƣợc khảo sát. . 4oC Bảo quản Lọc CGTase cố định trên alginat Dich lọc Bơm Xác định CGTase khơng cố định CaCl2 Nƣớc cất Alginat Khuấy to Khuấy CGTase Đệm Tris HCl 50 mM
Hình 2.5. Quy trình cố định CGTase trên alginat 2.1.3. Các chỉ tiêu theo dõi:
-Điều kiện cố định của CGTase trên các chất mang bằng các phƣơng pháp khác nhau
-Khả năng tái sử dụng enzym cố định trên từng loại chất mang
2.1.4. Sản phẩm nội dung cần đạt:
-Loại chất mang cĩ hiệu suất cố định protein tốt nhất -Số lần tái sử dụng của các enzym sau cố định
2.2. Thăm dị các thơng số của phản ứng tạo β-CD
2.2.1. Mơ tả nội dung:
Đối tƣợng nghiên cứu: các loại tinh bột
của Thiêm Ký (Việt Nam), cyclohexan (Xilong) đạt tiêu chuẩn của cyclohexan dùng trong nghiên cứu và enzym CGTase (Novozymes).
Quy mơ thực hiện: Thăm dị các thơng số pH, nhiệt độ, loại tinh bột thích hợp,
lựa chọn dung mơi thích hợp ..
Thời gian thực hiện: 01/2011 – 04/2011
Địa điểm thực hiện: Phịng Thí Nghiệm Vi Sinh Cơng Nghệ, Bộ mơn Vi sinh– Ký sinh, Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Tp.HCM
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Sản xuất thử nghiệm β-CD với các loại tinh bột khác nhau
Tiến hành sản xuất thử nghiệm β-CD với một số loại tinh bột khác nhau , từ đĩ tìm ra loại tinh bột thích hợp nhất.
Một số nguồn tinh bột dùng trong khảo sát: tinh bột sắn mì, tinh bột gạo, tinh bột khoai tây, tinh bột mì, tinh bột bắp đƣợc mua từ hãng sản xuất Thiêm Ký - Việt Nam.
Tiến hành sản xuất thử nghiệm β-CD với các loại tinh bột khác nhau này. Sử dụng tinh bột nồng độ 7% (kl/tt), enzym CGTase 900 U/L và cyclohexan 30% với tích phản ứng 100 ml. Từ đĩ chọn ra loại tinh bột thích hợp nhất cho việc sản xuất β- CD. [6, 42]
2.2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quy trình tạo β-CD
Từ loại tinh bột lựa chọn đƣợc trong khảo sát trên, tiến hành khảo sát các yếu tố khác nhƣ tỉ lệ dung mơi sử dụng, ảnh hƣởng pH và nhiệt độ đến phản ứng tạo β-
Khảo sát lƣợng dung mơi sử dụng:
Đối với các quy trình sản xuất β-CD với dung mơi, các dung mơi thƣờng sử dụng là benzen, xylen hoặc cyclohexan (xem Bảng 1.8). Trong đĩ cyclohexan đƣợc sử dụng nhiều nhất, bên cạnh đĩ trong các dung mơi nêu trên, cylohexan là dung mơi ít độc nhất và cĩ giá thành rẻ hơn so với các dung mơi cịn lại. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tơi chọn cyclohexan làm dung mơi để sản xuất β-CD. Tiến hành thí nghiệm với nồng độ tinh bột và lƣợng enzym đã khảo sát với lƣợng cyclohexan sử dụng lần lƣợt là 20 ml, 30 ml, 40 ml.
Khảo sát ảnh hƣởng của pH:
Với các thơng số đã chọn, khảo sát pH thích hợp cho quy trình sản xuất β-CD. Tiến hành thí nghiệm với các điều kiện pH 5, 6, 7, 8, 9.
Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ phản ứng là yếu tố cĩ ảnh hƣởng lớn đến khả năng tạo β-CD, enzym Toruzyme là enzym cĩ khả năng chịu nhiệt, do đĩ nhiệt độ phản ứng trong khoảng 50- 60oC, enzym cĩ hoạt tính cao, nhƣng ở nhiệt độ này tốc độ tạo phức của cyclodextrin và cyclohexan giảm. Do đĩ nhằm xác định nhiệt độ tối ƣu cho quy trình sản xuất β- CD, tiến hành thí nghiệm với các thơng số đã khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau 25oC, 30oC, 37oC.
2.2.3. β-CD theo Kaneko
Định lƣợng β-CD trong sản phẩm rắn [59]
Cân chính xác 0,1 g sản phẩm rắn thu đƣợc hịa tan trong bình định mức 50 ml với nƣớc cất.
Hút vào ống nghiệm 0,1 ml, thêm tiếp 0,9 ml maltodextrin 4%; 3,5 ml NaOH 30 mM; 0,5 ml phenolphtalein 0,02 %.
Để ổn định màu trong 15 phút, đo độ hấp thu ở bƣớc sĩng 550 nm. .
Lƣợng β-CD (%) cĩ trong sản phẩm rắn thu đƣợc tính theo cơng thức:
% β-CD = x 100 a x 200
∆OD-b
a : Hệ số gĩc đƣờng chuẩn b :
200 :
2.2.4. Các chỉ tiêu theo dõi
-Kiểm tra định tính sản phẩm tạo thành, định lƣợng nồng độ β-CD - Các thơng số quá trình sản xuất β-CD
2.2.5. Sản phẩm nội dung cần đạt
-Xác định loại tinh bột thích hợp nhất để sản xuất β-CD -Tỉ lệ dung mơi bổ sung vào dung dịch phản ứng
-Giá trị pH thích hợp cho phản ứng
-Điều kiện nhiệt độ thích hợp cho phản ứng
2.3. Tối ƣu hĩa quy trình tạo β-CD thơ
2.3.1. Mơ tả nội dung:
Đối tƣợ : Cảm quan: Màu