Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y XY DNG QUY TRÌNH TẠO TÊM NGUN BÀO SỢI NGƯỜI Trần Cơng Toại*; Tơ Minh Qn** TĨM TẮT Các tác giả sử dụng fibrin từ huyết người làm scaffold để phát triển vật liệu thay trung bì Nguyên bào sợi người ni cấy tới lần cấy chuyền thứ Để hình thành nguyên bào sợi, nguyên bào sợi người huyền phù keo fibrin, thêm CaCl2 để tạo thành nguyên bào sợi Kiểm tra mô học HE nguyên bào sợi ngày 8, 13, 15, 18 Ngoài ra, cịn ni ngun bào sợi bề mặt fibrin để chứng minh khả làm giá nuôi cy t bo tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 59 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y * Từ khóa: Nguyên bào sợi; Keo fibrin; Tấm trung bì Creation of human fibroblasts Tran Cong Toai; To Minh Quan SUMMARY The aim of this study was to develop a new method to create dermal graft composite for the treatment of various skin defects We utilized human plasma derived fibrin as the scaffold for the development of a living human dermal equivalent: fibrin - fibroblast (B - FF) Skin cells were cultured to passage For B - FF formation, human fibroblasts were suspensed in human fibrin matrix and add CaCl2 to solution for 60 t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống häc viƯn qu©n y making dermal sheet Dermal sheet were tested with HE staining on 8th, 13th, 15th, 18th day Another hand, we seeded a layer of fibroblast on the surface of fibrin sheet to prove the ability of sacffold for cell culture * Key words: Fibroblast; Fibrin glue; Dermal sheet ĐẶT VẤN ĐỀ nhân (BN) da [6] - Công nghệ mô da Tuy nhiên tồn hiệu chữa trị lớp feeder nguyên bào vết bỏng Rheinwald sợi chuột protein động Green nuôi cấy tế bào vật từ huyết phôi sừng phát triển tế bị ni cấy bào sừng làm vật liệu tạo phản ứng thải loại thay cho bệnh chậm Sử dụng tm t tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 61 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y bào sừng hạn chế lành vết thương nhanh ứng dụng lâm sàng tốt mặt mỏng manh, tỉ lệ thẩm mỹ [1, 7] chấp nhận mảnh ghép - Nhiều vật liệu thấp [1, 6] Vì vậy, phát thử nghiệm tạo cấu triển mảnh ghép da trúc 3D cho nguyên bào cách kết hợp sợi collagen, nguyên bào sợi nuôi collagen/chitosan, keo vật liệu sinh học khắc fibrin thương mại, huyết phục tốt hơn, làm làm thanh… [3] Trong tăng tỉ lệ chấp nhận nghiên mảnh ghép, quỏ trỡnh 64 cu ny, tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y * Tr-ờng Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch; ** Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Phản biện khoa học: GS TS Lê Gia Vinh sử dụng fibrin vật nguyên bào sợi liệu sinh học khn fibrin thu nhận từ huyết người Vì vậy, thu nhận từ người VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP bệnh, tạo thành trung bì tự thân từ fibrin nguyên bào sợi NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu tự thân [1, 4] - Mục đích nghiên cứu tạo cấu trúc 3D fibrin - nguyên bào sợi cách kết hợp - Lấy da sản phụ mổ đẻ hai lần sinh Sau lần mổ đẻ đầu tiên, vết cắt cổ tử cung hình thành tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 64 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y vt so Ở lần sinh thứ Phương pháp hai, cắt bỏ vết sẹo giữ vết nghiên cứu sẹo 4oC PBS • Tách nguyên bào sợi kháng sinh [2]: sử dụng - Thu da từ vết sẹo - Máu cuống rốn thu từ thai phụ hay vết da bòng, trẻ sinh theo phương lưu giữ PBS vô pháp tự nhiên, thai đủ trùng tháng - Dùng dao phẫu thuật - Da người huyết cắt bỏ lớp tế bào mỡ tương xét nghiệm âm thớt đĩa petri tính với HIV, HCV, HBV Cả hai sử dụng nhanh tốt - Da người ủ trypsin - EDTA 4oC 18 - Tách lớp tế bào sừng, dùng kéo ct lp trung bỡ 61 tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện qu©n y thành mảnh mơ 80% diện tích mơi nhỏ, sau chuyển mảnh trường) mơ vào bình Roux ủ - Tiến hành cấy chuyền đến lần thứ ba - Sau thêm ml • Thu nhận huyết mơi trường vào máu cuống rốn: bình Roux - Máu cuống rốn thu - Sau ngày, thay môi nhận từ thai nhi mổ trường cũ môi đẻ trường - Sau sinh, thu nhận - Cứ ngày lần máu cuống rốn ống tiến hành thay môi ly tâm 15 ml có chứa trường tế bào 1,25 ml natri citrate đạt đến mật độ cấy Ly tâm 3000 chuyền (khoảng 70 vịng/phút/5 phút Hút t¹p chí y - d-ợc học quân số 1-2009 62 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y huyt thanh, lc vào ống - Hút ml dung dịch tế bào đem ly tâm 3000 ly tâm • Tạo nguyên bào vòng/phút/5 phút sợi keo fibrin [1]: - Thêm ml huyết - Tiến hành cấy chuyền tương vào ống ly tâm có tế bào, huyền phù, đếm nguyên bào sợi F2 - Rửa bình ni 5.105 tế bào/ml PBS vô trùng hai lần - Ủ 2,5 ml trypsin EDTA 2,5% - Cho ml huyết tương có tế bào vào giếng đĩa giếng phút - Thêm 2,5 ml môi trường tế bào, chỉnh mật độ để bất trypsin - EDTA hoạt - Thêm 25 µl CaCl2 vào giếng - Ngày kế tiếp, hút bỏ huyết tương dư, thay 1,5 ml mơi trường 63 t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viƯn qu©n y ni ngun bào sợi, thay mơi trường - Hai ngày thay môi trường lần ngày/lần đem ngày thứ - Đem nguyên bào nhuộm HE sợi ngày 4, 8, 13, 15, 18 xét nghiệm mô học Những phương pháp xác định • Ni lớp ngun nghiên cứu bào sợi keo fibrin [6]: - Xác định nguyên bào sợi: sử dụng nhuộm - Cho ml huyết vimentin để xác định cuống rốn vào đĩa nguyên bào sợi đĩa giếng - Xác định nguyên - Cấy ml dịch tế bào bào sợi: sử dụng phương mật độ 5.105 tế bào/ml pháp nhuộm HE để xác lên bề mặt đĩa định cấu trỳc lp nguyờn bo si tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 64 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viƯn qu©n y Các tiêu cần - Thời gian hình thành nguyên bào sợi khảo sát - Sự hình thành nguyên bào sợi - Tách rời nguyên bào sợi tay KẾT QUẢ VÀ bµn LUẬN Kết ni trung bì sơ cấp Ngày 65 Ngày Ngày t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 1-2009 Ngy 15 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thèng häc viƯn qu©n y Hình 1: Ngun bào sợi Po lan từ mảnh mơ (x 10) t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 1-2009 64 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày trun thèng häc viƯn qu©n y - Sau ba ngày nuôi cấy, * Kết nhuộm tế bào bắt đầu lan vimentin: sau nhuộm, mảnh mô, ngày thứ có tế bào bắt màu dương tế bào đơn trải dài tính với vimentin Tế bào có màu nâu đậm thành hình thoi - Ngày thứ 7, nguyên Kết tạo keo bào sợi ngày nhiều, fibrin giai đoạn - Huyết nhận từ nguyên bào sợi tăng máu cuống rốn sau trưởng mạnh, xung thêm CaCl2 vào, khoảng quanh mảnh mơ có nhiều phút sau dịch fibrin tế bào đông đặc lại tạo thành - Ngày thứ 15, tế bào fibrin Tấm fibrin có hợp dịng, tạo thành màu vàng, xốp, dễ lớp đơn bề mặt nuôi dàng tách khỏi vật cấy chứa có hình dng ca vt cha 65 tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện qu©n y khơng quan 3D, phải len lỏi khoảng trống fibrin Nguyên bào sợi Hình 2: Nguyên bào sợi nhuộm vimentin Kết tạo nguyên bào sợi Hình 3: Nguyên bào - Một ngày sau tạo sợi keo fibrin ngày thành fibrin, nguyên (x 10) bào sợi fibrin trải dài có hình dạng cong, uốn khúc Điều khác với nguyên bào sợi đĩa Roux, - Tấm nguyên bào sợi cắt ngang cho thấy nguyên bào sợi phân bố fibrin Dựa tế bào trải dài t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 1-2009 66 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày trun thèng häc viƯn qu©n y vào hình ảnh nhuộm HE thấy lớp nguyên bào cắt ngang sợi mọc bề mặt nguyên bào sợi ngày fibrin Ngoài số tế 4, 8, 13, 15, 18, lượng bào len lỏi vào bên nguyên bào sợi nhiên đâm không sâu ngày 4, 8, 13 nhiều so số lượng tế bào không với ngày 15, 18, nhiều xác định sinh trưởng tốt 13 ngày đầu, giảm dần ngày sau KẾT LUẬN Nguyên bào sợi màng fibrin rút số nhận Sau cấy lên bề mặt fibrin, ngày sau nguyên bào sợi bắt đầu bám, trải dài Hình cắt ngang fibrin cho 67 Qua nghiên cứu, chúng xét: - Tạo nguyên bào sợi người fibrin tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện quân y - Tm nguyên bào sợi Reconstruction of living bóc tay dễ dàng bilayer human skin utilizing - Thời gian sử dụng equivalent nguyên bào sợi human fibrin as a khoảng tuần sau scaffold Burns, 2007, 33, pp 355 - 363 tạo - Fibrin có khả Current Protocols in cell làm giá thể nuôi tế bào biology, 1998, pp 211 - TÀI LIỆU THAM 212 KHẢO A L Mazlyzam, B S Aminuddin, N H Fuzina, M M Norhayati, O Fauziah, M R Isa, L Saimh, Ruszymah B Akira Takashima H I B L Seal, T C Otero, A Polymer material tisse and regeneration, Panich for organ Material science and Engineering tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 68 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viƯn qu©n y R 2001, 34, pp 147 - keratinocytes 230 and autologous fibrin sealant Béatrice Mis, Eric in a porcine wound Rolland, Vincent model British Journal of Ronfard Combined use Plastic Surgery, 2002, of a collagen - based 55, pp 219 - 227 dermal substitute and a L P Kamolza, M fibrin - based cultured Luegmair, N Wickb, B epithelium: a step toward Eisenbocka, S Burjaka, a total skin replacement R Koller, G Meissl, M for acute wounds Burns, Frey 2004, 30, pp 713 - 719 The Viennese culture method: cultured epithelium Grant, K Warwick, human J Marshall, C Green obtained on a dermal R Martin The co - matrix application of sprayed fibroblast cultured 69 based on containing autologous tạp chí y - d-ợc học quân số 1-2009 Số chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ngày truyền thống học viện qu©n y fibrin glue gels Burns, 2005, 31, pp 25 - 29 R E Horch, H Banasch, G B Stark Translation of cultured autologous keratinocytes in fibrin sealant biomatrix to resurface chronic wounds Transplantation Proceedings, 2001, 33, pp 642 - 644 tạp chí y - d-ợc học quân sè 1-2009 70 ... sợi Hình 3: Nguyên bào - Một ng? ?y sau tạo sợi keo fibrin ng? ?y thành fibrin, nguyên (x 10) bào sợi fibrin trải dài có hình dạng cong, uốn khúc Điều khác với nguyên bào sợi đĩa Roux, - Tấm nguyên. .. chuyên đề hinh tháI học chào mừng 60 năm ng? ?y truyền thống học viện quân y khụng quan 3D, phải len lỏi khoảng trống fibrin Nguyên bào sợi Hình 2: Nguyên bào sợi nhuộm vimentin Kết tạo nguyên bào. .. ảnh nhuộm HE th? ?y lớp nguyên bào cắt ngang sợi mọc bề mặt nguyên bào sợi ng? ?y fibrin Ngoài số tế 4, 8, 13, 15, 18, lượng bào len lỏi vào bên nguyên bào sợi nhiên đâm không sâu ng? ?y 4, 8, 13 nhiều