Xây dựng quy trình xác định các chất ma tuý tổng hợp amphetamin và methamphetamin trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng khối phổ

TỒNG QUAN VÈ CIIIẾT PHA RẮN m, 11],[2i],[27j Chiết pha rắn là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc tách chất phân tích từ mẫu bàng một chất rắn, sau đó rửa giải bằng một dung môi thích

Người hướng dẫn: TS Trần Việt Hùng

Hà Nội - 2009

trực tiếp hướng dẫn, chỉ báo tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn này.

Tôi xin gữ i lời cám ơn chăn thành đến Bart giảm đốc, các đồng nghiệp tại Viện Pháp V Quốc gia, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa Hóa pháp, Khoa Vật lý đo lường nơi tôi công tác và thực hiện đề tài

đã tạo điều kiện thuận lợi đế tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu trong thời gian qua.

Xin trân trọng cám ơn Ban Giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy

cô Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các Bộ môn khác của Trường Đại học Dược Hù Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học tập tại trường.

Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, người thân đã hết lòng động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 24 thảng 12 năm 2009

Phạm Quốc Chinh

Mục lục

Danh mục các chữ viết lắt

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN Đ È 1

Chưong 1: TỎNG QUAN LÝ THƯYÉT 3

1.1 TỎNG QUAN VÈ NHÓM CHẤT A T S 3

1.2 TỐNG QUAN VẺ AMPHETAM1N VÀ M ETHAM PHETAMIN 6

1.2.1 Công thức cấu tạo của AM và tính chất hóa l ý 6

1.2.2 Công thức cấu tạo của MA và tính chất hóa lý 6

1.2.3 Tác dụng dược lý và dược động học của AM và M A 7

1.3 TỐNG QUAN VẺ CHIẾT PHA RẢN 11

1.3.1 Các loại cột chiết pha rắn thông th ư ờ n g 13

1.3.2 Chế độ chiết pha ran hỗn hợp (mixed- m ode) 14

1.4 TỔNG QUAN VÈ SẮC KÝ LỎNG KIỈỐI PH Ổ 16

1.4.1 Thiết bị sắc ký lỏng khối p h ổ 17

1.4.2 Một số kỹ thuật LC/M S 22

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MA VÀ AM TRONG DỊCH SINH H Ọ C 23

1.5.1 Xử lý m ẫ u 23

1.5.2 Các phuong pháp xác đ ịn h 24

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 26

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIHN c ứ u 26

2.2 ĐIỀU KIỆN NGHIÊN c ử u 26

2.3.1 Lấy mẫu và bảo quản m ẫu 27

2.3.2 Chuẩn bị mẫu nghiên c ử u 28

2.3.3 Xử lý m ẫ u 29

2.3.4 Định tính và định lưọng AM và M A 27

2.4 ÁP DỤNG QUY [RÌNH DỀ PHÂN TÍCH MẪU MÁU VÀ NƯỚC TIÊU TI l ự c TÍ; 32

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ L IỆ U 32

Chương 3: KẾT Q U Ả 34

3.1 KẾT QUA XÂY D ự N G CHƯƠNG TRÌNH LC-MS ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG AM VẢ M A 34

3.1.1 Khảo sát lụa chọn cột phân tích và pha đ ộ n g 34

3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện khối p h ổ 37

3.1.3 Kháo sát phổ khối của AM, MA và P H 37

3.1.4 Thiết lập chưong trình LC-MS định tính, định lượng AM và M A 40

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PIIẢP 43

3.2.1 Đánh giá tính phù họp của hệ thống L C -M S 43

3.2.2 Đánh giá tính chọn lọc của phưong p h áp 45

3.2.3 Độ tuyến tính và độ iặp l ạ i 47

3.2.4 Đánh giá độ đúng phương p h á p 50

3.2.5 Đánh giá độ lặp lạ i 51

3.2.6 Đánh giá hiệu suất c h iế t 52

3.2.7 Xác định giói hạn phát hiện và giói hạn định lượng 52

4.1 VỀ QUY TRÌNH CHI ÉT 57

4.2 VÈ LC-MS VÀ THẢM ĐỊNH PHƯƠNG P I I Ả P 57

4.3 VỀ PHẢN TÍCII MẦU TI l ự c TÉ 59

KỂT LUẬN VÀ ĐÈ X U Ẩ T 60

KẾT LUẬN 60

KIẾN N G H Ị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢ O 63 PHỤ LỤC

Các chất kích thích thần kinh dạnu amphetamin CTPT : Cô nu thức phân tư

ESI : KỸ thuật ion hóa bàng phun diện tứ

RDS : Độ lệch chuủn tương dối (Relative Standard deviation)

SD : DỘ lêch chuân (Standard deviation)

SIM : Kỹ thuật phân lích chọn lọc ion

(Selected lon Monotoring)SPE : Chiết pha ran (Solid phase extraction)

TFA : TriHuoroacctic

TLPT : Trọng lượng phân tứ

Hình 1.2 Công thức của một số ATS diến hìn h 5

Hình 1.3 Con đườnti chuyên hoá cua methamphetamin 10

Hình 1.4 Cơ ché chiót SIM 13

Hình 1.5 Liên kết của chất phân tích với hệ chiết mix-mode 15

Hình 1.6 Cơ chế phân tách bànu chế độ chiết pha rắn hồn họp 16

Hình 1.7 Hệ thống LC/MS 17

Hình 1.8 Các bộ phận của detector khối p h ố 19

Hình 1.9 Kỹ thuật ESI 21

Hình 1.10 Bộ phân tích bẫy ion tứ c ự c 21

Hình 1.11 Bộ phàn tích tứ cực dơn 22

Hình 1.12 Bộ phân tích t ừ 22

Hình 1.13 Bộ phân tích thời uian bav 22

Hình 1.14 Bộ phàn tích cộnti hướng ion cyclotron 22

ITmh 2.15 Máy sắc ký lỏim sư dụng trong nghiên cứu 27

ỉũnh 3.16 Sắc ký dồ cua Pll, pha dộng MeOỈI - TFA 0,05 % (90:10) 35

ỉfình 3.17 Sắc ký đồ cua AM, pha dộng MeOH - TFA 0,05 % (90:10) 35

ỉfình 3.18: sắc ký đồ cua MA, pha động MeOII - TFA 0,05 % (90:10) 36

Hình 3.19 Phố khối MS và MS2 cua M A 37

Hình 3.20 Phổ khối MS và MS2 cua A M 38

ỉũnh 3.21 Phổ khối MS và MS: cua P H 39

Hình 3.22 sắc ký đồ của dunc, dịch chuẩn AM, MA và PH nồng độ 0,05|ag/ml 41

Hình 3.23 sắc kv dồ của AM AM và PH nồng độ 0,05|ig/ml sau khi đã xử lý 42

Hình 3.24 'rương quan hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của AM 44 Hình 3.25 Tương quan hồi quy tuyên tính giữa diện tích pic và nồng độ của MA 45 Hình 3.26 Sac kí đồ mẫu nước tiêu trắng 46 ỈTinh 3.27 sấc ký dồ mẫu nước tiếu có thèm chuẩn AM, MA và PH 0,005|ig/ml 46

Hình 3.30 Tương quan hồi quy tuvến tính giữa ti lệ AM/PH và nồng độ của AM

trong nước tiêu 49

Hình 3.31 Tương quan hôi quy tuyến tính giữa tỉ lệ MA/PH và nồng độ của AM trong nước tiếu 50

Hình 3.32 sắc ký đồ của AM, MA khảo sát LOD và L O Q 53

Hình 3.33 sắc ký dồ mẫu máu cua Vũ Duy c 56

Hình 3.34 Sac kv dồ mẫu nưức tiêu của Nguyễn Thanh H 56

Bảng 3.1 Các thông so cúa khôi phô dùne đe xác định AM và M A 40

Bảng 3.2 Ket quả khảo sát dộ lặp lại của hệ thống LC-MS 43

Bảng 3.3 Kết quá khao sát độ tuvến tính của AM và M A 44

Bảng 3.4 Đường chuẩn cua AM và MA trong máu 47

Bảng 3.5 Đường chuẩn cua AM và MA trong nước tiểu 49

Bảng 3.6 Ket quả khảo sát độ đúng của phương pháp với AM và MA trong máu và nước tiêu 51

Bảng 3.7 Ket quá khảo sát hiệu suất chiết cúa AM và M A 52

Bảng 3.8 Mầu trực tiếp gưi tới Viện Pháp y quốc g ia 54

Bảng 3.9 Mầu do viện Pháp y Quân đội g ử i 55

ĐẶT VẤN ĐÈ

Các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin ATS - Amphetamin Type Stimulants - có bán chấí hóa học là amphetamin(AM) hoặc những dẫn chất của amphetamin bị lạm dụng trên thế giới ngày càng tăng Tình hình sản xuất, vận chuyển, buôn bán và sử dụng các chất ma túy ATS trái phép trên thế giới và Việt Nam cũng ngày càng trở nên nghiêm trọng Trong những năm gần đây, số lượng và chủng loại các ATS tăng lên đáng kể, amphetamin và methamphetamin(MA) là một trong những ATS được sản xuất và sử dụng rất nhiều trong thực tế

Theo thống kê của Trung tâm Thông tin về ma tuý tổng hợp khu vực Châu Á - Thái Bình Dương (APAIC) của Cơ quan phòng chống ma tuý Liên Hợp Quốc (UNODC), hiện nay trên thế giới có khoảng 25 triệu người lạm dụng ma tuý tổng hợp ATS trong số đó có tới 60% thuộc khu vực Đông và Đông Nam Á Methamphetamin là chất được nhiều người sử dụng nhất, chiếm khoảng 60% 151

Ở nhiều nước trong khu vực Đông và Đông Nam Á như Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan , methamphetamin là loại ma tuý bị lạm dụng phổ biến nhất Theo UNODC, trong năm 2005, Thái Lan thu giữ lượng methamphetamin lớn nhất trong khu vực với số lượng trên 15 triệu viên, Lào đứng thứ hai với hơn 4,5 triệu viên và Myanmar đứng thứ ba với số lượng thu giữ khoảng hơn 3,5 triệu viên Trong những năm gần đây, hoạt động sản xuất methamphetamin bất hợp pháp tập trung nhiều ở địa bàn Trung Quốc và Myanmar nhưng trong thời gian vừa qua, một số quốc gia như Indonesia, Malaysia và Philipin lại có các báo cáo cho thấy sự gia tăng bất thường số vụ bắt giữ ma tuy tổng hợp dạng này.[5J

Xuất hiện ở Việt Nam vào những năm 1990 thì nay ATS đã lan khắp các tỉnh thành, đối tượng sử dụng ATS nhiều nhất là thanh thiếu niên, học sinh, sinh viên, tài xế lái xe đường dài, taxi phải thức qua đêm Ngoài ra, nếu thiếu hiêu biết, thì phụ nữ trung niên (muốn giảm cân) và học sinh đang lúc

ôn thi (muốn tỉnh táo) cũng dễ bị lôi kéo sử dụng Trong thời gian vừa qua các cơ quan chức năng đã phát hiện và triệt phá nhiều “động lắc” ở các thành phố lớn Tại hiện trường, lực lượng công an đã thu giữ được hàng ngàn viên

ma túy tống hợp và “thuốc lắc” Đối tượng bị bắt ở những nơi này còn rất trẻ, chủ yếu là thanh thiếu niên, học sinh sinh viên, thậm chí có đối tượng chỉ mới

15 tuổi Năm 2008, cả nước thu giữ khoảng 200.000 viên ATS.15'

Trên thế giới đã sử dụng nhiều phương pháp hiện đại để phân tích ATS trong nước tiếu, máu, trong khi đó các phương pháp phân tích phát hiện các chất ma túy nhóm này hiện nay ở Việt Nam còn nhiều hạn chế, ảnh hưởng đến việc đấu tranh phòng chống tội phạm ma túy Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng quy trình xác định ma túy tổng hợp amphetamin và methamphetamin trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) nhằm đưa ra quy trình chuấn giám định amphetamin và methamphetamin trong máu và nước tiểu ứng dụng trong các phòng xét nghiệm ở các thành phố lớn trên cả nước

Đe thực hiện được mục tiêu trên, nội dung của luận văn sẽ gồm 2 phần:

1 X ây dựng chương trình sắc kỷ lỏng khối p h ổ kết hợp chiết pha rắn (SPE)

đế định tính, định lượng amphetamin và methamphetamin.

2 Á p dụng các quy trình và phương pháp trên đ ể phân tích m ột sổ mẫu máu và nước tiếu nghi ngờ theo yêu cầu giảm định.

Chương 1 TỎNG QUAN LÝ THƯYÉT

1.1 TỒNG QUAN VÊ NIIÓM CHẤT ATS15 1'17 1’181’1 101

ATS là từ viết tắt của amphetamine type stimulants - Các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin - bao gồm nhiều chất có cấu trúc tương tự nhau, trong đó amphetamin là chất được phát hiện và tống hợp đầu tiên vào năm 1887 bởi một nhà hoá học người Đức, sau đó methamphetamin được một nhà hoá học người Nhật Bản tổng họp năm 1917 Trong suốt những năm

1970, amphetamin và methamphetamin đã được sử dụng trên lâm sàng với tác dụng kích thích thần kinh trung ương để điều trị bệnh ngủ rũ, bệnh trầm cảm

và đã có sự lạm dụng thuốc Từ đó, các tác dụng dược lý của amphetamin như chống mệt mỏi, tăng cường hoạt động tinh thần và thể chất, tạo hưng phấn, tăng lòng tự tin, tạo ảo giác đã bị lạm dụng ngày càng nghiêm trọng Cũng như các loại ma túy khác, khi dùng ATS sẽ bị quen thuốc và bị giảm tác dụng,

do đó người dùng phải tăng liều dần lên mới đạt được khoái cảm mong muốn Dùng liều cao thường xuyên có thể gây ra chứng loạn tinh thần, hoang tưởng,

dễ bị kích động và gây bạo lực, hành động không lí trí, rất dễ quậy phá và hành hung người Chính vì vậy, chúng được gọi là “ma túy điên” hay “ma túy bạo lực” Khi dừng sử dụng thuốc, người sẽ bị mệt mỏi, kém ăn, suy yếu kéo dài, ngủ chập chờn, cáu kỉnh, lo âu, thèm khát ma túy ghê gớm Đe trở lại cân bằng, người sử dụng tăng liều một cách có quy luật Các trường hợp nghiện lâu phải tăng từ 20 - 30 lần so với liều dùng ban đầu, có thể hàng trăm lần Khi dùng liều tăng cao đột ngột sẽ bị ngộ độc cấp tính, có thể dẫn đến chết

Trong số các chất ATS, methamphetamin là một chất được sử dụng rất rộng rãi do tác dụng gây ảo giác mạnh và dễ dàng tổng họp, thậm chí trong những phòng thí nghiệm có điều kiện vật chất thông thường Ngày nay do lợi

nhuận khổng lồ từ việc sản xuất, buôn bán các chất ATS, việc sử dụng các chât này đã lan rộng trên phạm vi toàn thế giới trong đó có Việt Nam.

Trên thị trường tự do chúng thường ở dạng viên nén, viên nang và có màu khác nhau như m àu hồng (hồng phiến), màu xanh (thanh phiến), màu nâu hoặc màu trăng và có mùi thơm cua vanilin Trên bề mặt của viên thuốc thường có các chữ : V, w, WY, EVA, DAM các ký hiệu, hình vẽ khác nhau

và dược gọi dưới nhiều tên khác nhau như thuốc con voi, thuốc điên, thuốc đầu ngựa Ngoài ra ATS còn tồn tại ở dạng ống tiêm, bột tinh khiết, tinh thể tuyết

Một số m a tủy nhóm ATS với hình dạng và m àu sắc khác nhau được thể hiện ở hình 1.1

Công thức chung của nhóm ATS

1.2 TỔNG QUAN VỀ AMPHETAMIN VÀ METHAMPHETAMIN

1.2.1 Công thức cấu tạo của AM và tính chất hóa Iý|2l [3| f41 l16J f26l

+ Tên khoa học: (+) -N , a-dimethylphenethylamin

1.2.3 Tác dụng dược lý và dược động học của AM và MA• o • % > • • o •

1.2.3.1 Tác dụng dược Ạ5.12]-I4]-[7I.[8]

Tác dụng kích thích thần kinh của amphetamin và methamphetamin là rất nhanh, thậm chí ngay trong khi tiêm Thời gian tác dụng có thể kéo dài tới 4-8 giờ Tác dụng kích thích thần kinh tăng lên khi kết họp với các nhóm thuốc khác như ephedrine, cocain, các chất giảm đau gây ngủ nhóm opiat, các thuốc ngủ Sau đây là tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng của chúng

**»* Tác dụng kích thích hệ thần kinh trung WY /W£ / |5|'|7I'I23I'|25I'1261

Amphetamin và methamphetamin tác dụng chủ yếu lên não, vỏ não, ngoài ra còn tác dụng lên hệ thống lưới hoạt hóa của hệ thần kinh trung ương Các tác dụng này gây ra những thay đối trạng thái tinh thần như các cảm giác sảng khoái, tỉnh táo, phấn chấn tinh thần, nhanh nhẹn, tăng tính năng động, tăng vận động, nói năng, giảm mệt mỏi, dịu đau Vì cảm giác đó nên người đã

sử dụng có xu hướng thèm muốn tiếp tục sử dụng hết lần này đến lần khác dẫn đến nghiện Việc dùng kéo dài hoặc dùng liều lớn thường gây ra chán chường mệt mỏi, ảo giác, hoang tưởng, hoảng loạn, đau đầu, chóng mặt, rối loạn vận mạch, lẫn lộn, suy nhược tinh thần, suy giảm khả năng tình dục

Điều này là do chúng làm não tăng phóng thích ít nhất 3 chất hóa học trung gian dẫn truyền thần kinh: serotonin, dopamine và norepinepherin (đây là chất

có vai trò chuyến tải xung động thần kinh từ tế bào thần kinh này sang các tế bào thần kinh khác) Serotonin có vai trò chủ yểu trong việc điều khiển tính tình, cảm xúc, giấc ngủ, cảm giác đau và sự thèm ăn cũng như các hành vi khác Cùng với sự phóng thích một số lượng lớn serotonin, chúng còn cạnh tranh lên các thụ thế với serotonin, làm nó không được hấp thu trở lại gây nên cạn kiệt chất dẫn truyền xung động thần kinh Chính sự cạn kiệt chất dẫn truyền serotonin khiến các tế bào thần kinh bị chết Việc sử dụng chúng thường xuyên trong thời gian ngắn cũng sẽ huỷ hoại các tế bào sản xuất dopamin (chất kiếm soát nhận thức và tình cảm) trong não Hậu quả là khả năng cảm nhận niềm vui, nỗi buồn bị tiêu diệt

*1* Tác dụng kích thích hệ thần kinh giao [23] 12 5 1 1 2 6 1

Methamphetamin và amphetamin có tác dụng kiểu a và ị3 như các chất cường giao cảm

- Tác dụng trên mạch: ATS kích thích làm tăng nhịp tim, ảnh hưởng

trực tiếp ỉên tim, gây co thắt mạch vành tạo nên con đau thắt ngực, nặng hơn

có thế gây nhồi máu cơ tim Chúng cũng là nguyên nhân của các rối loạn nhịp

đe dọa tính mạng người lạm dụng “thuốc lắc” Ngoài ra còn gây nên tình trạng co mạch làm tăng huyết áp Vì vậy, với những người vốn có bất thường ở hệ tim mạch hoặc có các nguy cơ của bộnh tim mạch, nếu sử dụng

"‘thuốc lắc” sẽ vô cùng nguy hiểm, có thế gây tai bién bất cứ lúc nào

- Tác dụng trên cơ trơn khác: Tác dụng ức chế nhu động dạ dày, ruột,

làm giảm co thắt đối với dạ dày, ruột

- Tác dụng giảm đau: Các ATS có tác dụng giảm đau nhẹ, tuy nhiên

chưa đủ để điều trị hiệu quả Mặc dù vậy, theo một số báo cáo chúng có thể làm tăng tác dụng giảm đau của các chất nhóm opiat

- Kích thích trung tâm hô hấp: Đối với người bình thường tác dụng

không đáng kế nhưng khi đã bị ức chế bởi các chất tác dụng trên hệ thần kinh trung ương thì chúns có tác dụng kích thích hô hấp rõ rệt

- Gây chán ăn: Vị trí tác dụng của ATS là trung tâm no ở vùng dưới

đồi bên

- Đôi với hệ sinh dục: Không như người ta thường lầm tưởng, dùng

“thuốc lắc” sẽ làm tăng khả năng tình dục Ở người, khả năng tình dục suy giảm một cách rõ rệt, và hậu quả này vẫn tồn tại sau khi ngưng dùng thuốc một thời gian khá lâu Ớ những nam giới dùng thuốc lắc trong thời gian dài sẽ

bị chứng vú to và bất lực Còn ở phụ nừ sẽ bị rối loạn chu kỳ kinh nguyệt, rong kinh, tăng tiết sữa, vô sinh

Ỉ.2 3.2 Dưực động học[m '2l[ll]

[ĩĩ'-Dễ dàng hấp thu qua đường uống và đường trực tràng, nó được phân bố nhanh vào máu Đào thải chủ yếu qua đường nước tiểu và phụ thuộc vào pH của nước tiếu Đào thải nhiều hơn khi nước tiểu acid và giảm khi nước tiểu kiềm Thời gian bán thải của methamphetamin là 10 giờ và của amphetamin

là 11-13 giờ

Khi uống amphetamin, 30% được đào thải qua nước tiểu trong 24 giờ đầu ở dạng không biến dổi, 0.9% ở dạng phenylaceton, 16-28% ở dạng acid hippuric, 4% dạng benzoinglucuronid, 2% dạng norephedrin, 2-4% dạng p- hydroxyamphetam in

Khi uống methamphetamin, trong 24 giờ đầu nó được đào thải qua nước tiếu 43% ở dạng không biến đổi, 15% ở dạng 4-hydroxy- methamphetamin, 5% ở dạng amphetamin (là chất chuyển hoá có hoạt tính chủ yếu) và một số chất chuyến hoá khác cũng được tìm thấy dưới dạng biến đối hoặc kết hợp I lình 1.3 biểu diễn sự chuyển hóa của AM và MA

Hình 1.3 Con đường chuyển hoá của methamphetamin

1.2.3.3 Độc tm hị2UỈWU2ìi

v ề mặt độc tính, amphetamin ít độc hơn methamphetamin

Với amphetamin: Ở liều điều trị 20-100mg/ngày có thể run, tim đập nhanh, giãn đồng tử, mất ngủ Ở liều cao gấp 5-10 lần liều điều trị có thể rối loạn phong cách, nhầm lẫn, hung hãn, ảo giác Liều rất cao có thể rối loạn thần kinh, tim đập nhanh, co giật, tăng huyết áp, phù phổi và tử vong KJhi uống lOmg đối với người 70kg thì nồng độ trong máu sau 2 giờ là 0,035mg/l,

T 1/2=11-13 giờ LDso=l 17mg/kg

Với methamphetamin: ít được sử dụng trong điều trị do độc tính cao Khi uống lOmg đối với người 70kg thì nồng độ trong máu sau 3,5 giờ là 0,020mg/l, T 1/2 = 1 0 giờ LD50=15-20mg/kg

1.3 TỒNG QUAN VÈ CIIIẾT PHA RẮN m, 11],[2i],[27j

Chiết pha rắn là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc tách chất phân tích từ mẫu bàng một chất rắn, sau đó rửa giải bằng một dung môi thích hợp nhằm loại các chất có ảnh hưởng tới chất cần phân tích, làm giàu chất trước khi tiến hành phân tích chúng Phương pháp này ra đời trong những năm 60-

70 của thế kỷ 20, và từ đó đến nay đã được phát triển, ứng dụng rộng rãi, nhất

là trong phân tích các dược chất và chất chuyển hoá trong dịch sinh học như máu, huyết thanh, nước tiểu

Chiết pha rắn dược thực hiện với các mục đích chính cũng là những ưu điếm chủ yếu của phương pháp này:

■ Tập trung mẫu hay làm giầu mẫu

Thông thường, thành phần phân tích trong mẫu ở mức quá thấp để phát hiện, xử lý mẫu bằng SPE cho phép tập trung chất phân tích tới mức nào đó

đủ đế phát hiện

■ Làm sạch mẫu

Ngoài ra, chiết pha rắn còn có các ưu điểm:

• Chất phân tích được thu hồi cao và tương đối sạch

• Lượng dung môi dùng ít, do đó ít ảnh hưởng đến người làm

• Thời gian phân tích nhanh, có thể làm nhiều mẫu cùng lúc

• Có thê kết nối với GC hoặc HPLC, dễ tự động hóa quá trình phân tích

• Có nhiều lựa chọn cột chiết, cơ chế cột chiết đa dạng, phù họp với chất phân tích, do đó có tính chọn lọc tốt

Quy trình chiết gồm các bước:

- Xử ỉý cột bằng dung môi và dung dịch đệm thích hợp: Đe hoạt hóa cột

nhằm chuyển pha rắn sang trạng thái có thể lưu giữ chất phân tích

- Tách chất phân tích: Mầu trong dung dịch được cho qua cột, pha rắn sỗ

lưu giữ chất phân tích và một số tạp

- Loại tạp: Dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho qua cột để loại một số

tạp đã được giữ lại trên pha rắn

- Rửa giải: Dùng dung môi hay hỗn hợp dung môi thích họp để đẩy chất

phân tích ra khỏi pha rắn, lấy dịch chiết và xác định bằng phương pháp thích họp

Hình 1.4 Cơ chê chiêt SPE

1.3.1 Các loại cột chiết pha rắn thông th ư ờ n g1'11271

Nguyên liệu đê chiết pha ran gồm pha không liên kết như silicagel, magnesi silicat hay pha liên kết gồm bề m ặt chất hấp phụ được gắn thêm các nhóm chức hóa học để tạo ra cơ chế chiết theo kiểu sắc ký phân bố hoặc nhóm chức trao đổi ion

r Trao đôi ion

Nguyên liệu chiết pha rắn của trao đổi ion thường là dẫn chất của phenylsulfonic, acid carboxylic, amon bậc 4

Tùy tính chất của pha rắn mà cơ chế lưu giữ và rửa giải cũng khác nhauĐối với chiết pha rắn trao đổi ion, lực tương tác giữa chất phân tích và pha liên kết là lực hút tĩnh điện

1.3.2 Chế độ chiết pha rắn hỗn hợp (mixed- mode).

Đối với các mẫu là dịch sinh học như máu, nước tiểu, huyết tương, thành phần của chúng thường là hỗn hợp nhiều chất gây nhiễu phức tạp Trong nước tiểu là các họp chất hữu cơ, protein, urea, muối, cặn bẩn Khi sử dụng chiết pha đảo để cô lập và tinh khiết chất phân tích, những chất gây nhiễu này sẽ cùng bị hấp phụ bởi cột và cùng bị rửa giải với chất phân tích, do

đó một phương pháp chiết pha rắn mới được ra đời dựa trên sự kết hợp các cơ chế liên kết đã có sẵn là phương pháp chiết hỗn hợp Thuật ngữ mixed-mode hàm chứa sự kết hcTp giữa các cơ chế phân bố, thường là pha đảo và trao đổi cation Trong chế độ này, chất phân tích và chất gây nhiễu cùng liên kết với pha rắn nhưng chất phân tích được liên kết với pha rắn bằng hai loại tương tác: Tương tác vandervvaals và tương tác tĩnh điện, trong khi đó chất gây nhiễu ở lại trên cột chủ yếu tham gia tương tác vanderwaals, dùng một dung môi rửa các chất gây nhiễu bàng cách cất đi các liên kết Vanderwaals, chất phân tích còn lại trên cột sẽ được rửa giải ra sau đó bằng các dung môi thích

họp Nguyên liệu cho chế độ chiết pha rắn hỗn hợp cũng được tạo nên nhờ sự kết hợp của pha đảo (C8 hoặc C18) và các nhóm trao đổi cation mạnh.

Hình 1.5 L j ê n kết của chất phân tích với hệ chiết mix-mode

Cơ chế phân tách và cô lập chất phân tích được thể hiện cụ thể qua 4 bước chính sau:

-Bước 1: Hoạt hóa cột bằng dung môi hữu cơ và dung dịch đệm, đưa

mẫu lên cột, rứa cột bằng nước đã loại ion

-Bước 2: Khóa cột bang acid HC1 0,1N, acid sẽ giúp tạo liên kết ion

giữa N2 của ATS và nhóm sulfonic của chất hấp phụ

-Bước 3: c ắ t các liên kết Vandervvaals bàng MeOH, do đó các chất gây

nhiễu sẽ bị loại bỏ, chất phân tích nằm lại trên cột

-Bước 4: Rửa giải bằng dung môi thích hợp để cắt liên kết ion của chất

phân tích và chất hấp phụ

Hình 1.6 Mô tả sự phân tách methamphetamin bàng cột chiết mix-mode

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và kỹ thuật phân tích khổi phổ (MS)

là hai kỹ thuật đã ra đời khá lâu Tuy nhiên mãi đến những năm 1970 người ta mới nhận ra lợi ích to lớn của việc kết hợp chúng với nhau, nguyên nhân của

sự chậm trễ này là vấn đề kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống khối phổ có độ chân không cao Kể từ đó đến nay sắc ký lỏng khối phổ không ngừng phát triển và chứng minh được tầm quan trọng của mình trong phân tích

Pha động trong sắc ký lóng khối phổ thường là các dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù họp Có hai cách dùng pha động đê rửa giải:

-Đ ăng dong' Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình

sắc ký

-Gradient: Pha động là hồn hợp của nhiều dung môi, tỷ lệ các thành phần

thay đôi trong quá trình sắc ký theo chương trình dung môi đã định Chế độ rửa giải gradient n ồng độ thích hợp với những m ẫu phân tích gồm nhiều thành

phần có độ phân cực khác nhau nhiều, khi đó chế độ này giúp rút ngắn thời gian phân tích và tăng độ phân giải.

r H ệ thống bơm

Bơm HPLC có chức năng tạo áp suât cao đê đây pha động từ bình dung môi qua hệ thống sắc ký Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu:

- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên

- Dảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 ịil - 5,0 mL/phút

- Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi

r Cột tách và ph a tĩnh

Cột HPLC thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30cm, đường kính trong 4-10mm Kích thước của hạt nhồi trong cột thường là 5-10|im Các chất nhồi thường được sử dụng là Silica gel, nhôm oxyd, polyme xốp hoặc các loại pha đảo C2, C8, C18

Cột tách sác ký lỏng yêu cầu phải trơ, có thành phang, đồng nhất trên bề mặt

và có thê chịu được áp suất cao

•r H ệ tiêm mẫu

Mau ở dạng lỏng được tiêm thang vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bàng một van tiêm có vòng chứa mẫu Đây là một ưu điểm lớn của HPLC vì có thể tích chính xác, độ lặp lại rất cao

r H ệ thống điều khiển và thu nhận, x ử lý dữ liệu

'['oàn bộ hệ thống LC/MS được kết nối với máy vi tính đã cài đặt phần mềm thích hợp, người phân tích giao tiếp với hệ thống qua máy tính trên phần mềm này đế điều khiến, theo dõi quá trình phân tích, nhận thông tin vào xử lý thông tin

- Có tính chọn lọc, phân tích đúng và chính xác đối tượng phân tích

- Có độ nhạy cao (Phân tích được hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp vì dòng khối phổ nhạy)

r Các bộ phận của detector khối phổ

Hình 1.8 Các bộ phận của detector khối phổ

- Nạp mẫu: Trong LC-MS bộ nạp mẫu là đầu ra của máy HPLC kết

nối với máy khối phổ

- Nguồn ion: Là bộ phận ion hóa mẫu có nhiệm vụ: lon hóa chất cần phân tích, khử dung môi đế đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyến với bộ phận nằm trong chân không sâu, và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo

Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyến, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp

Kỹ thuật sử dụng trong luận văn này là kỹ thuật ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat hay kỹ thuật ion hóa bằng tia điện - Electronspray ionization, ESI Kỹ thuật này như sau:

Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế 3-4kV (điện thế dương ở đầu kim loại tạo ion dương, và ngược lại), sau đó được phun mịn bằng khí N2 thoát ra xung quanh ống mao quản Dưới tác động của điện thế và của dòng khí N2 có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản Trong khí nóng, các phân tử dung môi bị bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ vỡ dần thành những hạt nhỏ mang điện tích Sau đó các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí N2 bị bơm hút ra ngoài

- Bộ phân tích khối: Bộ phân tích khối được coi là quả tim của m áy

khôi phô có nhiệm vụ tách các ion có tỉ số m/z khác nhau thành những phần

riêng biệt Các ion được gia tốc và tách riêng n hờ tác dụng của từ trường,

điện trường đế đi đến detector Bộ phân tích khối trong luận văn này là bộ

phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole ion trap)

Thế xoay chiều tần số radio áp vào cực tm n g tâm sẽ đưa các ion vào

chuyển động tròn trong hốc với quỹ đạo ổn định Bằng cách thay đổi thế xoay

chiều làm cho các ion có m/z xác định chuyển động theo quỳ đạo không ổn

định rơi vào cực phía dưới bẫy Bộ phận nhận electron của detector sẽ thu

nhận và phát hiện ion

H ình 1.10 Bộ phân tích bẫy ion tứ cực

Hình 1.13 Bộ phân tích thời gian Hình 1.14 Bộ phân tích cộng

- Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín

hiệu điện đo bàng hệ điện tử của máy khối phô Hiện có hai dạng truyền

thống: Nhân electron và nhân quang, trong luận văn này, bộ phận phát hiện

ion là dạng nhân electron

1.4.2 M ôt số kỹ thuât LC/M S• V •

1.4.2 l.K ỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN).

Với một hồn họp nhiều chất, sau khi được tách ra qua cột sắc ký lỏng và

đưa vào detector khối phổ khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh

ra từ mồi chất Ta có một sắc đồ toàn ion TIC (Total Ion Chromatogram) và phổ khối được lấy toàn bộ các ion (FULL SCAN)

FULL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

1.4.2.2 K ỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring).

Kỹ thuật này chỉ cho khối phố kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian Kỹ thuật SIM có có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do

đó tăng độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu s/ N

Kỹ thuật SIM nhạy hơn FULL SCAN

1.4.2.3 Kỹ thuật MS/MS.

Trong kỳ thuật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2

Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MA VÀ AM TRONG DỊCH SINH

cơ, dạng muối tan tốt trong nước do đó người ta thường chuyển qua lại giữa

hai dạng acide, base đê chiêt và làm sạch với dung môi ether, dung môi nàv thường cho hiệu suất chiết cao.

1.5.1.2 K ỹ thuật chiết pha rắn.

Kỹ thuật chiết pha rắn đặc biệt là ở chế độ Mixed-mode được sử dụng rộng rãi trên thê giới đê xử lý các mẫu sinh học Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết pha rắn đế xử lý mẫu phân tích

1.5.2 Các phương pháp xác định111'^1’161’19^ 111119^1251'12611291

r Phương pháp sắc kỷ

Sắc ký khí là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trên thế giới đế phân tích ATS Pha động trong sắc ký khí thường là khí trơ, pha tĩnh có thể là chất lỏng được bao hay găn trên một chất mang là pha rắn, hoặc là chất rắn hấp phụ Mầu phân tích được đưa vào đầu cột và quá trình rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký Do chất tan chỉ có thể di chuyển theo pha

động qua cột khi nó ở thể khí, kỹ thuật này được dùng để tách những chất tan

bền với nhiệt Các chất ATS trước khi phân tích sắc ký khí phải được dẫn xuất hóa đề tạo thành hợp chất dễ bay hơi, bền, không bị phân hủy bởi nhiệt trong điều kiện sác ký, detector thường dùng là detector ion hóa ngọn lửa

r Phương pháp sắc ký’ khí khối phô GC/MS’*11'14^ 61'17^ 151’1191

Ket nối sắc ký khí khối phổ cũng được sử dụng rất rộng rãi để phân tích ATS Dùng máy sắc ký khí để tách ATS, dòng khí sau khi ra khỏi máy sắc ký khí sẽ đi vào máy khối phổ, máy khối phố được xem như detector để định tính, định lượng ATS với độ nhạy và độ chọn lọc tốt Tuy nhiên ATS phải được dẫn xuất hóa với trước khi phân tích

r Phương pháp sắc ký lóng hiệu năng CÍ7Ớ1

Săc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phân tách hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng hòa tan nhau, một pha động và một pha tĩnh Pha động là chất lỏng chảy qua

cột với một tốc dộ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiếu phân, hoặc một chất lỏng phủ trên bề mặt một chất mang hay nọt chất mang rắn đã được biến đổi bàng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xảv ra dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc loại trừ theo kích cỡ.

r Phương pháp phân tích miễn dịch /?oc'4^ 29'

Nguyên lý của phương pháp miễn dịch học là sử dụng một kháng thể đặc hiệu với chất cần phân tích (là kháng nguyên) và dạng đánh dấu của chất cần phân tích Dạng đánh dấu của chất cần phân tích sẽ tranh chấp với chất đó để kết hợp với kháng thể theo cơ chế phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể Ket quả là số lượng các phân tử chất bị đánh dấu sẽ tỷ lệ nghịch với lượng chất cần phân tích có trong mẫu Tùy thuộc vào bản chất của chất đánh dấu

mà các phương pháp phân tích thích hợp sẽ được áp dụng Khi sử dụng chất phân tích miễn dịch học cho các chất kích thích thần kinh trung ương nhóm ATS, cần chú ý ràng nhiều thuốc kiểu amphetamin có thể có phản ứng chéo với các kháng thê kháng amphetamin và methamphetamin sử dụng trong các phân tích miễn dịch này Phương pháp này được ứng dụng để chế tạo các kit xác định nhanh ma túy ATS

Chưcmg 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ử u

Đối tượng nghiên cứu là amphetamin và methamphetamin trong mẫu nướctiếu, máu Mầu nước tiểu và máu tự tạo, mẫu nước tiểu và máu của ngườinghi ngờ sử dụng ma túy gửi đến giám định tại Khoa Hóa pháp - Viện Pháp yQuốc gia và Viện Pháp y Quân đội

2.2 DIỀU KIỆN NGHIÊN c ứ u

- Máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS Thermo Surveyor Finnigan

- Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Agilent - Technologies 1200 với detector PDA

- Cột sắc ký Agilent SB-C18 (15cm X 5mm, 3,5|im)

- Hệ thống chiết pha ran Agilent technologies

- Cột chiết pha rán A ccuB O N D II Evidex Cartridges, 200mg, 3ml HàngAẹilent technologies (Cột mix-mode: Trao đôi cationit và pha đảo)

- M áy lắc siêu âm Branton 5200

2.3.1 Lấy mầu và báo quản mẫu

Mầu máu và nước tiêu được gửi đến hoặc lấy trực tiếp tại Khoa I lóa pháp Viện Pháp y Quốc gia, dựng trong ống thủy tinh sạch Mầu dược xử lý ngay hoặc bảo quán trong tủ lạnh ở nhiệt độ 0 - 4°c Do tính chất pháp y, thường thời hạn bao quan không quá 24 giờ

2.3.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

♦ĩ* Mẩu chuẳn:

- Các ống chuấn MA, AM và PH nồng độ lmg/mỉ được pha thành dung dịch 10 |ig/ml trong methanol Từ các dung dịch chuẩn này pha loãng thành các nồng độ khác nhau (0,005|Líg/ml - l^g/ml)

- Dung dịch chuẩn amphetamin và methamphetamin l|ig/m l pha trong pha động để khảo sát phổ khối

- Chuấn nội phenylephrin 1 ng/ml đe khảo sát phố khối

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp amphetamin, methamphetamin 0,5|ig/ml và chuẩn nội phenylephrin 0,l|ig/m l để khảo sát chương trình chạy khối phổ

*1* Các mẫu nước tiếu và máu nhiễm

Sử dụng mẫu máu và mẫu nước tiểu trắng thêm chuẩn đe có các dung dịch nhiễm

Đường chuan trong máu và trong nước tiếu: Tạo đường chuẩn trong nước

tiểu và trong máu có nồng độ 0,005 |!g/ml, 0,025 |ig/ml, 0,05 |ig/ml, 0,250 Ịig/ml, 0,500 |ig/ml và 1,000 ng/ml, chuẩn nội PH 0,1 fig/ml Chuẩn bị dãy các ống thủy tinh chứa 5ml máu hoặc nước tiểu trắng, đánh số từ 1-6 Thêm lần lượt 100|il, 50|il và 25jnl dung dịch chuẩn hồn hợp AM và MA 10 fig/ml vào các ống sô 1, 2 và 3 Với các ống nghiệm số 4, 5 và 6 thì sử dụng dung dịch chuấn 0,1 |ig/ml với lượng đưa vào tương ứng là 500 |il, 250 |il và

50 ]Lil Thêm 100 Ị.il dung dịch chuấn nội phenylephrin 1 |ig/ml trong methanol vào tất cả các ống nghiệm trên, lắc mạnh, thu được các mẫu để tạo đường chuẩn Xử lý theo quy trình ở mục 2.3.3 Các mẫu này sử dụng để khảo sát độ đúng của phương pháp, độ lặp lại, tính chọn lọc, lập đường chuân

M ẩu khảo sát độ đúng: Độ đúng của phương pháp được khảo sát bằng mẫu

tự tạo Chuẩn bị các mẫu AM và MA trong mẫu nước tiểu và máu trắng ở

nồng độ: 0,05(.ig/ml (cách tiến hành giống như chuấn bị dung dịch số 4 của đường chuấn) Tiến hành chiết và phân tích sắc ký theo quy trình đã xây dựng Nồng độ tìm lại của chất phân tích so với giá trị biết trước có trong mẫu được dùna đế đánh giá độ đúng của quá trình phân tích.

2.3.3 Xử lý mẫu

Xử lý mẫu, làm sạch và làm giàu mẫu bằng chiết pha ran (SPE), sử dụng cột chiết hỗn hợp kết hợp trao đổi cation và pha đảo (mixed mode) với quy trình như sau:

*1* Xử lý mẫu:

- Lấy 5 ml nước tiểu hoặc 5 ml máu vào trong ống thủy tinh (16x100 mm) Với mẫu máu thì thêm 5ml dung dịch đệm phosphat 0,1M pH7 Lắc siêu âm trong 10 phút, ly tâm 5 phút và lấy lớp dung dịch

- Thêm 100 |il dung dịch chuẩn nội phenylephrin l|Lig/ml trong methanol

♦> Làm sạch và làm giàu mẫu

Cột AccuBOND II Evidex Cartridges, 200mg, 3ml

* Luyện cột: Cho 3ml methanol chảy qua cột, điều chỉnh tốc độ chảy 2ml/phút (sử dụng bơm hút áp suất giảm) Thêm 3ml dung dịch đệm phosphat 0,1M pH7 tốc độ 2ml/phút Nạp mẫu vào cột với tốc độ 2ml/phút Rửa cột với

10 ml nước cất, tốc độ 5 ml/phút Thêm 5 ml dung dịch HC1 0,1N tốc độ 5 ml/phút Hút khô cột 1 phút, thấm ưcrt cột bằng 1 OOjLtl dung môi rửa giải Rửa giải băng 5ml dung dịch Etyl acctat: Methanol: Amoniac tỉ lệ 80:18:2 (v/v) tốc độ 2ml/phút Thêm 2-3 giọt dung dịch HC1 IN, làm khô dưới dòng khí N2

ở 46HC Ilòa cặn bằng lml pha động rồi tiến hành phân tích sắc ký

♦ĩ* Khảo sát hiệu xuất chiết

Khảo sát hiệu suât chiết đối với amphetamin và methamphetamin ở 2 nồng độ 0,05|ig/ml và l ?00|ag/ml Chuẩn bị mẫu chuẩn amphetamin và methamphetamin ở các nồng độ đã nêu, tiến hành chiết pha rắn theo quy trình

trên, sử dụng dưng dịch chuấn thay vì mẫu thử Tiến hành phân tích sắc ký theo chương trình đã xây dựng Hiệu suất chiết được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích píc của dung dịch chuẩn cùng nồng độ giữa chuẩn chạy qua cột và chuân không qua cột.

2.3.4 Định tính và định lượng AM và MA

2.3.4.1 Kháo sát xây dựng chương trình sắc ký

Sử dụng dung dịch chuấn AM và MA l^g/m l trong pha động tiêm vào hệ thống HPLC với detector PDA để khảo sát lựa chọn cột, tìm pha động thích hợp

2.3.4.2 Xây dựng chương trình sắc ký khối pho

- Chương trình sắc ký: pha động, tốc độ dòng đã được khảo sát ở trên

- Tối ưu điều kiện khối phổ với AM, MA và PH: Tiêm trực tiếp các dungdịch chuân có nồng độ l|ig/ml trong methanol vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5 ỊLil/phút, sử dụng phương pháp điều chỉnh tự động (Autotune) của máy LC-MS

- Khảo sát diều kiện khối phố

+ Kỳ thuật MS 1 làn, phân tích toàn thang xác định mảnh mẹ (ion phân tử)+ kỳ thuật MS 2 lần, phân tích toàn thang tìm những ion con đặc trưng (mảnh

mẹ và mảnh con) đe định tính

+ Kỹ thuật chọn lọc ion (SIM), sử dụng ion phân tử (mảnh mẹ) để định lượng

2.3.4.3 Thâm định phươnq pháp phân tích

**** Sự phù hợp của hệ thống sắc ký

Sự phù họp của hệ thống sắc ký được khảo sát trên hai yếu tố:

- Độ lặp lại cua hệ thong: Khảo sát trên cùng dung dịch chuẩn (AM, MA)

có nồng độ 0,05^g/ml, tiêm lặp lại 6 lần Độ lặp lại của hệ thống sắc ký lỏng khối phó được đánh giá dựa vào độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của

hai yếu tố thời gian lưu và diện tích pic của chất chuẩn amphetamin, methamphetamin.

- Khoảng nồng độ tuyến tính: Khảo sát dãy các dung dịch chuẩn (AM, MA)

trong khoảng nồng độ từ 0,005-1 |ig/ml Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi quy giữa tín hiệu phân tích (diện tích píc, chiều cao píc hoặc tỉ số diện tích, chiều cao) và nồng độ chất phân tích Chuấn bị dãy dung dịch chuấn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích

mẫu xác định phương trình hồi quy i}’=ax+b) và hệ số tương quan r.

♦> Đánh giá phương pháp phân tích

- Tỉnh chọn lọc: Tính chọn lọc là khả năng phân biệt các chất trong mẫu thử

khi tách và định lượng các thành phần trong hợp chất Vì nền mẫu gồm nhiều thành phần phức tạp nên độ chọn lọc được khảo sát dựa trên sắc ký

đồ của mầu máu, nước tiểu trắng; mẫu máu, nước tiểu trắng thêm amphetamin methamphetamin và chuẩn nội

- Tính đặc hiệu: Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối detertor khối phổ 2 lần

LC-MS/MS) là một trong những phương pháp có tính đặc hiệu cao Tính đặc hiệu thê hiện ở sự xuất hiện các mảnh khối đặc trưng của chất (mảnh ion phân tử M + l, mảnh ion tạo thành đặc trưng)

- Độ tuyên tỉnh và độ lặp lại: Đánh giá trên đường chuẩn trong nước tiếu và

máu có nồng độ từ 0,005|ig/ml-l |!g/mi

- Độ đúng: Dộ đúng được xác định bằng phương pháp mẫu tự tạo (mẫu máu

và nước tiêu trăng thêm chuấn), tiến hành định lượng đế xác định khả năng tìm lại

- Giới hạn ph á t hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ chất thấp nhất của chất phân tích có thê xác định được về mặt định tính nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể LOD được coi là nồng độ chất