3.1.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử
a. Chuẩn bị dung môi pha mẫu
Qua nghiên cứu tài liệu tham khảo vàtiến hành khảo sát, tôi lựa chọn dung môi pha mẫu là hỗn hợp: acetonitril : đệm phosphat pH 2,5 (70 : 30), đây cũng chính là pha động.
Cách pha đệm phosphat pH 2,5: cân khoảng 3,9 g natriumdihydrogenphosphat dihydrat (NaH2PO4.2H2O) và hòa tan vào 900 ml nước. Điều chỉnh pH về giá trị 2,5 bằng dung dịch acid phosphoric 85%, bổ sung nước tới đủ 1000 ml.
Đệm sau khi pha được lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm trên máy lọc hút chân không sau đó trộn với acetonitril theo tỉ lệ: acetonitril : đệm phosphat pH 2,5 (70 : 30), sau đó siêu âm tới hết bọt khí, chỉ sử dụng hỗn hợp dung môi này trong ngày.
b. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử
Cân khối lượng 20 viên, tính khối lượng trung bình 1 viên. Nghiền mịn thuốc thành bột, cân lượng bột tương ứng với 3 mg dược chất cho vào bình định mức 10 ml. Thêm methanol tới 2/3 bình, đem siêu âm trong 10 phút, sau đó để yên 10 phút rồi thêm methanol tới vạch. Đem ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút, trong thời gian 10 phút. Hút chính xác 5 ml dịch ly tâm cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung môi pha mẫu tới vạch, lắc kĩ. Dịch pha được đem lọc qua màng 0,2 µm trước khi chạy sắc ký. Dung dịch này có nồng độ chất phân tích khoảng 0,15 mg/ml. Làm đồng thời với các chế phẩm của simvastin và calci atorvastatin.
3.1.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu
- Vì các chất khảo sát đều tan tốt trong methanol nên tôi quyết định lựa chọn methanol làm dung môi để pha và bảo quản dung dịch chuẩn gốc.
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác lượng chất chuẩn tương ứng với 25 mg dược chất chuẩn cho vào bình định mức dung tích 25 ml, thêm khoảng 20 ml methanol, lắc siêu âm 5 phút, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc kĩ. Làm đồng
thời với cả 2 chất chuẩn. Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml được bảo quản theo yêu cầu trên nhãn. Dung dịch này được pha loãng tới nồng độ thích hợp để khảo sát và xây dựng dãy dung dịch chuẩn.
- Mẫu chuẩn đơn: hút chính xác 1,5 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm pha động tới vạch và lắc kĩ. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,2 µm trước khi đem chạy sắc ký. Dung dịch chuẩn đơn này có nồng độ chất chuẩn khoảng 0,15 mg/ml. Làm đồng thời với simvastatin và calci atorvastatin. - Mẫu chuẩn kép: hút chính xác 1,5 ml dung dịch chuẩn gốc của mỗi chất cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm pha động tới vạch và lắc kĩ. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,2 µm trước khi đem chạy sắc ký. Dung dịch chuẩn kép này chứa cả hai chất chuẩn ở nồng độ 0,15 mg/ml.
3.2. KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký
Qua các tài liệu nghiên cứu về định lượng calci atorvastatin và simvastatin, tôi thấy rằng các phương pháp đều sử dụng sắc ký phân bố pha đảo. Hiện nay sắc ký phân bốpha đảo là phương pháp được sử dụng khá phổ biến với nhiều tính ưu việt. Do đó, tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này.
Sử dụng cột hiện có là cột sắc ký Apollo C18 5u (4,6 x 250 mm, 5µm).
3.2.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện
Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện simvastatin và calci atorvastatin, tôi thực hiện quét phổ UV mẫu chuẩn đơn của cả hai chất. Mẫu chuẩn đơn được chuẩn bị theo quy trình ở mục 3.1.2. Kết quảthu được như sau:
(a) (b)
Hình 3.1.Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn của mẫu simvastatin (a) và của mẫu
Kết quả cho thấy simvastatin có độ hấp thụ lớn nhất tại bước sóng 238nm. Do đó lựa chọn bước sóng này để định lượng simvastatin. Với calci atorvastatin, các hấp thụ cực đại tại 3 bước sóng 194nm, 224nm, 246nm. Để giảm sai số do dung môi, tôi lựa chọn bước sóng để phân tích là 246nm là bước sóng mà calci atorvastatin hấp thụ lớn thứ 2.
Tiến hành chạy sắc ký các mẫu chuẩn đơn khảo sát của cả 2 chất ở 2 bước sóng 238 nm và 246 nm thu được kết quả về chiều cao của pic như sau:
- Simvastatin: 278 mAU (tại 238 nm) và 205 mAU (tại 246 nm)
- Calci atorvastatin: 469,85 mAU (tại 238 nm) và 488,3 mAU (tại 246 nm)
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép tại hai bước sóng 238 nm và 246 nm
Ta thấy chiều cao pic của simvastatin thấp hơn nhiều so với calci atorvastatin và tại bước sóng 238 nm chiều cao pic của calci atorvastatin thay đổi không đáng kể. Do đó để ưu tiên và cải thiện chiều cao pic của simvastatin tôi lựa chọn bước sóng 238 nm để định lượng đồng thời 2 statin này.
3.2.3. Lựa chọn pha động
Tiến hành khảo sát với chương trình sắc ký như tài liệu tham khảo [22, 23] pha động là acetonitril : đệm phosphat pH 4,5 (70 : 30), tốc độ dòng 1,2 ml/phút , bước sóng 238 nm. Kết quảthu đươc sắc ký đồ như sau:
(a)
(b)
Hình 3.3.Sắc ký đồ mẫu khảo sát lựa chọn pha động với đệm pH 4,5 của mẫu
simvastatin (a) và mẫu calci atorvastatin (b)
Kết quả thu được cho thấy pic của simvastatin khá cân đối, hệ số đối xứng cao (0,923) trong khi pic của calci atorvastatin có hệ sốđối xứng rất thấp (0,633), pic bị kéo đuôi.
Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát pha động với đệm được điều chỉnh pH với các giá trị pH lần lượt là 5,0; 4,0; 3,0 và 2,5. Kết quảthu được như bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát pH đệm
pH đệm Hệ số bất đối xứ
ng
Simvastatin Calci atorvastatin
5,0 0,978 0,614
4,5 0,923 0,633
4,0 0,957 0,739
3,0 0,989 0,789
2,5 0,992 0,888
Từ kết quả cho thấy tại các pH khảo sát hệ số bất đối xứng của simvastatin duy trì ổn định ở mức cao (trên 0,9). Trong khi đó, với calci atorvastatin tại pH 5,0; 4,0 và 3,0 hệ số bấtđối xứng không thay đổi nhiều và vẫn thấp (< 0,8); tại pH 2,5 hệ số
bất đối xứng được cải thiện đáng kể(0,854), đường nền thẳng không nhiễu. Do đó chúng tôi lựa chọn đệm tại pH 2,5 để chạy sắc ký. Sắc ký đồ thu được ở Hình 3.4.
Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn kép ở pH 2,5
3.2.4. Tỉ lệ pha động và tốc độ dòng
Nhằm tối ưu hóa pha động và điều chỉnh thời gian lưu chúng tôi tiến hành khảo sát pha động acetonitril : đệm phosphat pH 2,5 với tỉ lệ pha động và tốc độ dòng thay đổi. Kết quảthu được được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷlệ pha động và tốc độ dòng
Tỉ lệ pha động
Chất
Thời gian lưu với v = 1,0 ml/phút (phút)
Thời gian lưu với v = 1,1 ml/phút (phút)
Thời gian lưu với v = 1,2 ml/phút (phút) 65:35 CA 5,373 4,912 4,485 SIM 17,583 16,025 14,852 68:32 CA 4,802 4,465 4,014 SIM 15,571 14,166 13,157 70:30 CA 4,617 4,081 3,848 SIM 13,790 12,721 11,532 72:28 CA 4,219 3,997 3,817 SIM 13,412 12,405 11,517
Qua bảng kết quả ta thấy để thời gian lưu của 2 chất tương đối gần nhau và không quá dài, tối ưu hóa pha động, tốc độ dòng tôi lựa chọn pha động là acetonitril : đệm phosphat pH 2,5 với tỉ lệ 70 : 30 và tốc độ dòng là 1,2 ml/phút. Với điều kiện
đó thời gian lưu của calci atorvastatin và simvastatin lần lượt là 3,848 phút và 11,532 phút (Hình 3.5). Thời gian lưu này là hợp lý, pic gọn, tách hoàn toàn
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép theo chương trình chạy đã xây dựng
Như vậy qua kết quả khảo sát thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn các điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời simvastatin và calci atorvastatin trong chế phẩm như sau:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 G 1314A kết nối với detector UV-Vis
- Cột sắc ký Apollo C18 5u ( 4,6 x 250 mm, 5µm) - Pha động: Acetonitril : đệm phosphat pH 2,5 (70 : 30) - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
- Thể tích tiêm: 10 µl - Bước sóng ghi: 238nm
Với chương trình chạy như trên cho kết quả: các pic tách tốt, thời gian lưu tương đối gần nhau, hệ số bất đối xứng cao.
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
3.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống
Để đánh giá một phép định lượng bằng HPLC mới xây dựng, trước hết ta tiến hành khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc kí. Việc khảo sát tiến hành bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc kí theo chương trình đã chọn. Độ thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua hệ số kéo đuôi, sốđĩa lý thuyết, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic.
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn kép theo quy trình đã trình bày ở mục 3.1.2. Tiêm 6 lần mẫu chuẩn kép vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích và hệ số kéo đuôicủa pic tạo bởi calci atorvastatin và simvastatin. Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.3.Tính tương thích hệ thống
STT
Pic calci atorvastatin Pic simvastatin Thời gian lưu (phút) Diện tích (mAU.s) Thời gian lưu (phút) Diện tích (mAU.s) 1 3,861 2844,516 11,547 3901,167 2 3,864 2856,299 11,551 3895,437 3 3,868 2851,414 11,546 3905,773 4 3,862 2867,894 11,549 3893,487 5 3,859 2862,482 11,551 3897,441 6 3,860 2865,392 11,545 3889,334 TB 3,862 2857,999 11,548 3897,105 SD 0,003 8,952 0,003 5,798 RSD (%) 0,08 0,31 0,02 0,15 Hệ số bất đối xứng 0,872 0,987 Số đĩa lý thuyết 25453 39838
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy
- Số đĩa lý thuyết N = 39838 với simvastatin và N = 25453 với calci atorvastatin, hệ số bất đối xứng simvastatitin AF = 0,872, với calci atorvastatin AF = 0,987. Các thông số này đều nằm trong giới hạn cho phép (N ≥ 2000, 0,8 ≤ AF ≤ 2,0) chứng tỏ việc tách hai chất có tính phù hợp.
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông sốđặc trưng của quá trình sắc ký là thời gian lưu và diện tích pic từ 0,002% đến 0,31% nằm trong giới hạn cho phép. Điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký đảm bảo được tính thích hợp của hệ thống đối với
việc phân tích định tính và định lượng đồng thời simvastatin và calci atorvastatin trong chế phẩm.
3.3.2. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp
Mục đích: chứng minh sự có mặt của dung môi pha mẫu và các chất khác không ảnh hưởng đến việc định lượng simvastatin và calci atorvastatin.
Cách tiến hành: simvastatin làm với chế phẩm viên nén Simvastatin 10mg (STADA - VN), calci atorvastatin tiến hành lặp với chế phẩm Lipitad – calci atorvastatin 10mg (STADA - VN). Chuẩn bị các mẫu như sau:
Mẫu trắng: dung môi pha mẫu
Mẫu chuẩn đơn của calci atorvastatin và của simvastatin: chuẩn bị như đã trình bày ở mục 3.1.2
Mẫu thử của calci atorvastatin và của simvastatin: chuẩn bị như mục 3.1.1
Mẫu thử thêm chuẩn của calci atorvastatin và simvastatin: chuẩn bị như mẫu thử đối với từng chất như đã trình bày ở mục 3.1.1 nhưng cho thêm 0,5 ml dung dịch chuẩn gốc trước khi bổ sung pha động tới vạch. Làm đồng thời với cả calci atorvastatin và simvastatin trên hai chế phẩm tương ứng. Mẫu thử thêm chuẩn có nồng độ chất phân tích khoảng 0,2 mg/ml
Mẫu chuẩn kép: chuẩn bị như đã trình bày ở mục 3.1.2
Kết quả: Mẫu trắng không có tín hiệu phân tích. Các mẫu thử đơn đều cho một pic duy nhất tương ứng với dược chất có trong mẫu. Các mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn kép đều cho các pic trên sắc ký đồ tương ứng với calci atorvastatin và simvastatin (phụ lục 1).
Ngoài ra khi so sánh phổ của pic trong mẫu thử đơn và mẫu chuẩn giá trị phù hợp (hệ số match) đạt xấp xỉ 100% (phụ lục 2). Như vậy phương pháp định lượng vừa xây dựng có tính chọn lọc.
3.3.3. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
Chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của simvastatin và calci atorvastatin trên các dung dịch chuẩn.
Tiến hành sắc ký với 6 dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau của chất phân tích. Kiểm tra sự tương quan và biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ chất phân tích bằng hệ số tương quan và phương trình hồi quy.
Cách pha: chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc theo quy trình đã trình bày ở mục 3.1.2. Từ dung dịch chuẩn gốc, hút chính xác 10 ml cho vào bình định mức dung tích 20 ml, bổsung pha động tới vạch, thu được dung dịch chuẩn A có nồng độ chất chuẩn 0,5 mg/ml. Từ dung dịch chuẩn A này, hút chính xác các thể tích theo lần lượt là 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 4,4; 5,0 ml với simvastatin và 1,0; 2,0; 2,4; 3,0; 4,0; 5,0 với calci atorvastatin cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung môi pha động vừa đủ tới vạch, lắc đều. Lọc qua màng 0,2 µm và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic đo được ứng với các nồng độ của các dung dịch trên. Kết quả được trình bày ở các bảng sau:
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của simvastatin
Nồng độ (mg/ml) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,22 0,25 Diện tích pic (mAU.s) 1340,15 2703,49 3897,12 5201,54 5749,66 6542,02 Phương trình đường chuẩn S = 25823,9289C + 61,1282 với R2 = 0,9996 (Hệ số tương quan hồi quy R=0,9998)
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của
simvastatin y = 25823,9289C + 61,1282 R² = 0,9996 0 2000 4000 6000 8000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 D i ệ n t íc h p ic ( m A U .s ) Nồng độ (mg/ml)
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của calci atorvastin Nồng độ (mg/ml) 0,05 0,07 0,12 0,15 0,2 0,25 Diện tích pic (mAU.s) 1424,17 1716,85 2389,14 2856.30 3499,07 4195,42 Phương trình đường chuẩn S = 13831,0205C + 743,8155 với R2 = 0,9997
(Hệ số tương quan hồi quy R=0,9998)
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của
calci atorvastatin
Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độchấtnghiên cứu, với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (với cả hai chất đều có hệ số tương quan R=0,9998). Kết quả này được sử dụng làm cơ sở để lựa chọn nồng độ định lượng các chất nghiên cứu.
3.3.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Cách bố trí thí nghiệm: tiến hành lặp lại 6 lần cùng một mẫu thử theo quy trình xử lý mẫu (mỗi mẫu làm độc lập, bắt đầu từ cân lượng bột thuốc tương ứng với 3 mg dược chất). Simvastatin tiến hành làm với chế phẩm viên nén Simvastatin 10mg (STADA - VN), calci atorvastatin tiến hành lặp với chế phẩm Lipitad – Calci atorvastatin 10mg (STADA - VN). y = 13831,0205C + 743,8155 R² = 0,9997 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 D i ệ n t íc h p ic ( m A U .s ) Nồng độ (mg/ml)
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với calci atorvastatin và simvastatin
TT
Mẫu Litipad (calci atorvastatin) Mẫu STADA (simvastatin) Lượng bột viên thử (mg) Hàm lượng so với nhãn (%) Lượng bột viên thử (mg) Hàm lượng so với nhãn (%) 1 44,8 98,82 45,8 99,78 2 44,9 100,03 45,7 99,35 3 44,7 100,10 45,7 99,24 4 44,8 99,88 46,8 99,67 5 45,7 99,96 46,7 99,97 6 45,7 100,15 45,6 99,75 Trung bình 99,99 99,79 SD 0,13 0,28 RSD (%) 0,13 0,28
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt qua 6 lần phân tích độc lập đều có giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thấp: 0,13% với calci atorvastatin và 0,28% với simvastatin. Như vậy, phương pháp phân tích xây dựng đã thể hiện độ lặp lại tốt, phù hợp với mục đích nghiên cứu.
3.3.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng cách xác định độ thu hồi: thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu thử, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại 4 lần bằng phương pháp khảo sát.
Lượng chuẩn thêm vào bằng 10%, 20%, 30% lượng dược chất có trong mẫu thử. Tiến hành sắc ký mẫu thử không thêm chuẩn và các mẫu thử có thêm chuẩn, mỗi mẫu làm 4 lần. Tính tỷ lệ thu hồi từ chênh lệch nồng độdược chất xác định được