Chuẩn bị mẫu
Dung dịch chuẩn gentiopicrin được chuẩn bị bằng cách cân chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn gentiopicrin (cân có d = 0,01 mg) vào bình định mức 25 ml, sau đó hòa tan và thêm một lượng vừa đủ
methanol để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 0,2 mg/ml. Lắc đều và lọc qua màng lọc 0,45 µm ta được dung dịch sắc ký.
Dung dịch thử: Lấy thuốc của 5 đơn vị chế phẩm được chọn ngẫu nhiên. Trộn đồng nhất. Cân chính xác khoảng 0,50 g chế phẩm vào ống nghiệm 10 ml, thêm 6 ml methanol, lắc xoáy trong 10 giây, siêu âm theo thời gian khảo sát, đun cách thủy, đậy kín miệng ống nghiệm bằng giấy bạc. Để nguộị Chuyển toàn bộ vào bình định mức 10 ml, rửa ống nghiệm 3 lần mỗi lần với khoảng 1 ml methanol. Tập trung dịch rửa vào bình định mức trên. Thêm methanol đến vừa đủ thể tích. Lắc đềụ Đem ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, dịch trong phía trên lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký.
Tiến hành:
- Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn gentiopicrin. Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic. Phép thử chỉ có giá trị khi RSD của thời gian lưu và diện tích pic gentiopicrin không quá 2,0 %.
- Sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn gentiopicrin và dung dịch thử. Ghi các sắc ký đồ với các thông số thời gian lưu và diện tích pic của gentiopicrin tương ứng.
Hàm lượng gentiopicrin (X %) trong kem Viemda AD được tính theo công thức:
(%) =A × m × 10
A × m × 25× 100%
Trong đó:
của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
mt và mc: Khối lượng (g) mẫu thử và mẫu chuẩn. Cc: Hàm lượng (%) gentiopicrin trong chất chuẩn.
Thẩm định phương pháp định lượng gentiopicrin trong kem Viemda AD:
Tiến hành thẩm định qui trình định lượng theo hướng dẫn của ICH [14], bao gồm các chỉ tiêu:
- Tính chọn lọc — đặc hiệu
Chuẩn bị dung dịch mẫu placebo từ mẫu placebo tương tự mẫu thử, mẫu thử từ chế phẩm kem Viemda AD, mẫu chuẩn gentiopicrin 0,2 mg/ml như cách chuẩn bị mẫu ở trên. Tiến hành sắc ký.
Yêu cầu: Thời gian lưu, hình dạng pic gentiopicrin trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn phải tương tự nhaụ Trên sắc ký đồ của mẫu placebo, tại vị trí ứng với pic của gentiopicrin không xuất hiện pic.
- Khoảng nồng độ tuyến tính
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gentiopicrin có nồng độ 0,10 – 0,30 mg/ml, với ∆ = 0,05 mg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch trên theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn và ghi lại diện tích píc. Từ đó xác định mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic gentiopicrin với nồng độ tương ứng.
Yêu cầu : Đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan xấp xỉ 1.
- Độ chính xác
Chuẩn bị mẫu chuẩn gentiopicrin 0,2 mg/ml và 6 mẫu thử riêng biệt từ cùng một mẫu kem Viemda AD như cách chuẩn bị mẫu ở trên. Tiến hành phân tích. Xác định hàm lượng gentiopicrin trong mẫu thử dựa vào diện tích pic gentiopicrin trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu chuẩn, lượng cân chế phẩm và lượng gentiopicrin chuẩn đã dùng.
Độ chính xác trong ngày (độ lặp lại) được xác định dựa trên giá
trị RSD của 6 lần phân tích. Yêu cầu RSD thu được không lớn hơn 2,0 %. Độ chính xác khác ngày (độ chính xác trung gian) được xác định tương tự như xác định độ lặp lại với 6 mẫu độc lập nhưng ở ngày phân tích khác trên cùng một mẫu chế phẩm. Yêu cầu RSD thu được không lớn hơn 3,0 % đánh giá trên 12 mẫu trong 2 ngày khác nhaụ
- Độ đúng
Tiến hành bằng phương pháp mẫu tự tạọ Thêm chính xác một lượng chất chuẩn gentiopicrin vào các mẫu placebo tương ứng với 3 mức: 80 %, 100 % và 120 % nồng độ định lượng (nồng độ gentiopicrin trong dung dịch tiêm sắc ký là 0,16 – 0,20 và 0,24 mg/ml). Dựa vào diện tích peak của gentiopicrin trong sắc ký đồ của các mẫu thử (mẫu placebo thêm chuẩn) và mẫu chuẩn, lượng gentiopicrin chuẩn bị dung dịch chuẩn xác định được phần trăm tìm lại của gentiopicrin chuẩn thêm vàọ
Yêu cầu độ tìm lại nằm trong khoảng 98 – 102 %. 2.4.4 Đánh giá kết quả:
Sử dụng phần mềm Microsoft Excelvới các công thức liên quan: Giá trị trung bình: ̅ = ∑
Độ lệch chuẩn: S= ∑ ( ̅)
Phương sai: S2= ∑ ( − )2
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) =
̅× 100 Trong đó:
xi: là lần xác định thứ i n: là số lần xác định
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM-KẾT QUẢ-BÀN LUẬN
3.1 Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất gentiopicrin
3.1.1 Quy trình xử lý mẫu
Xử lý mẫu nghiên cứu
Gentiopicrin trong mẫu thử được chiết bằng dung môi hòa tan mẫu, dùng siêu âm và đun hồi lưu cách thủỵ Dịch chiết được định mức đến thể tích bằng dung môi hòa tan mẫu tới nồng độ phù hợp cho phép phân tích được dung dịch thử.
Dung dịch chuẩn gentiopicrin được chuẩn bị bằng cách cân một lượng chính xác chất chuẩn gentiopicrin, sau đó hòa tan và pha loãng chính xác trong dung môi hòa tan mẫu để được dung dịch có nồng độ phù hợp cho phép phân tích.
- Dung môi hòa tan mẫu
Khi tiến hành khảo sát chúng tôi thấy rằng MeOH và EtOH đều hòa tan tốt chế phẩm kem Viemda AD. Tuy nhiên, đối với cao đặc long đởm (thành phần chính của chế phẩm) thì MeOH hoà tan hoàn toàn còn EtOH hòa tan kém hơn ở cùng một điều kiện. Từ kết quả thực nghiệm này chúng tôi chọn dung môi MeOH làm dung môi hòa tan mẫu và pha động.
- Thời gian chiết mẫu (thời gian siêu âm)
Tiến hành khảo sát quá trình xử lý mẫu ở các thời gian chiết khác nhau thu được kết quả được trình bày ở Bảng 3.1 và Hình 3.1
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu Stt Thời gian chiết
(phút)
Khối lượng mẫu (m) (g)
Diện tích pic (A) (mAU*s)
Tỷ số A/m
2 15 0,5867 1795,45 3060,2
3 20 0,5095 1857,47 3645,7
4 25 0,5116 1802,27 3522,8
5 30 0,5053 1833,07 3627,7
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic và khối lượng mẫu(A/m) so với thời gian chiết
Chọn thời gian chiết mẫu: 20 phút, có tỷ số A/m cao nhất là 3645,68. Thời gian siêu âm dài cho kết quả gần tương đương nhưng tốn thời gian hơn. - Điều kiện cách thủy
Tiến hành đun cách thủy ở 600C (nhiệt độ sôi của MeOH là 650C) trong thời gian khác nhau thu được kết quả được trình bày Bảng 3.2 và Hình 3.2 dưới đây:
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thời gian đun cách thủy Stt Thời gian đun
cách thủy
Khối lượng mẫu (m) (g)
Diện tích pic (A) (mAU*s) Tỷ số A/m 2700 2800 2900 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700 10 15 20 25 30 tỷ số A/m Thời gian (phút)
(phút)
1 10 0,5049 1592,82 3507,9
2 15 0,5245 1893,34 3609,8
3 20 0,5131 1813,07 3533,6
4 25 0,5087 1592,82 3131,2
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa tỷ số diện tích pic và khối lượng mẫu và thời gian đun cách thủy
Từ bảng kết quản khảo sát thời gian đun cách thủy chọn thời gian cách thủy: 15 phút, có tỷ số A/m cao nhất 3609,8. Cách thủy trong thời gian dài có thể làm bay hơi dung môi chiết gây hiện tượng bão hòa, không hòa tan hết dược chất.
Từ các kết quả thu được ở trên: quá trình xử lý mẫu được tiến hành trong điều kiện sau:
Dung môi pha mẫu: MeOH
Thời gian chiết mẫu: 20 phút
Điều kiện cách thủy: thời gian 15 phút ở nhiệt độ 600C 3.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký
2800 2900 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700 10 15 20 25 tỷ s ố A /m
Dựa vào đặc tính của chế phẩm, tính chất của gentiopcrin và qua tham khảo tài liệu [14]chúng tôi tiến hành khảo sát thực tế để lựa chọn các điều kiện sắc ký
Tỷ lệ pha động
Tiến hành sắc ký, thay đổi tỷ lệ pha động MeOH : H2O trên cùng một mẫu chuẩn, so sánh thời gian lưu và diện tích pic của chất phân tích được trình bày trong Bảng 3.3
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thành phần pha động
Tỷ lệ 25:75 27:73 30:70 35:65 40:60
TR (phút) 13,938 11,399 8,780 6,079 4,538
Áp suất cột 183 196 202 221 230
Nhận xét:
Khi tỷ lệ MeOH trong pha động tăng thì thời gian lưu của chất phân tích giảm dần
Tỷ lệ MeOH : H2O trong pha động là 35 : 75 cho hiệu quả tách tốt và có thời gian lưu hợp lý (6,07 phút)
Tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động càng lớn thì áp suất cột trong quá trình sắc ký càng caọ
Như vậy, có thể xem xét hai tỷ lệ MeOH : H2O là 30 : 70 hoặc 35 : 75 để có thời gian phân tích hợp lý. Tuy nhiên cần khắc phục áp suất cột.
Tốc độ dòng
Từ kết quả khảo sát thành phần pha động trên ta tiến hành sắc ký thay đổi tốc độ dòng trên cùng một mẫu chuẩn với tỷ lệ pha động cố định MeOH - H2O là 30 : 70, theo dõi thời gian lưu và áp suất cột thu được kết quả ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động Tốc độ dòng (ml/phút) 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 TR(phút) 12,733 11,564 10,364 9,534 8,923 Áp suất cột (bar) 168 183 203 221 234 Nhận xét:
Tốc độ dòng càng lớn thì thời gian lưu giữ chất phân tích càng giảm ( tR càng nhỏ)
Tốc độ dòng càng lớn thì áp suất cột càng cao: áp suất cột cao trên 200 bar dễ gây hỏng cột, kết quả không ổn định
Từ những kết quả trên, có thể nhận thấy tốc độ dòng giảm thì áp suất cột cũng giảm, tại lưu lượng dòng 1,0 ml/phút hệ MeOH : H2O (30 : 70) áp suất cột không quá cao (p = 168 bar) nhưng tR dài 12,7 phút; còn khi dùng hệ MeOH : H2O (35 : 75), tR hợp lý 6,08 phút nhưng do lưu lượng lớn 1,4 ml/phút nên áp suất cột cao (221 bar). Do đó chúng tôi tiến hành chạy sắc ký với tỷ lệ pha động MeOH : H2O (35 : 65) và tốc độ dòng 1,0ml/phút thu được kết quả sắc ký đồ có tR = 8,146 phút (Hình 3.3), áp suất cột trong khoảng 169 - 173 bar.
Hình 3.3: Sắc ký đồ gentiopicrin chuẩn ở điều kiện sắc ký đã lựa chọn
Phổ cực đại hấp thụ
Tiến hành quét phổ hấp thụ của pic gentiopicrin mẫu chuẩn ở điều kiện sắc ký đã khảo sát thu được kết quả được trình bày ở Hình 3.4.
Hình 3.4: Phổ hấp thụ chất phân tích
Từ phổ hấp thụ thu được ta thấy gentiopicrin mẫu chuẩn cho cực đại hấp thụ ở bước sóng 270 - 275 nm. Trong phạm vi đề tài chúng tôi lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại là 270 nm khi tiến hành sắc ký.
Kết quả: sắc ký được tiến hành trong điều kiện:
Cột: Cột phân tích pha đảo Inertsil C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm). Detector: UV 270 nm.
Pha động: MeOH : H2O Tỷ lệ pha động: 35 : 65 Tốc độ dòng: 1ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10µl
Nồng độ gentiopicrin trong dung dịch mẫu tiêm: khoảng 0,2mg/ml 3.1.3 Quy trình phân tích
gentiopicrin trong kem Viemda AD như sau:
1) Xử lý mẫu
Cân một lượng chính xác khoảng 0,5 g mẫu thử cho vào ống nghiệm 10 ml. Thêm khoảng 6 ml MeOH, lắc xoáy, siêu âm trong 20 phút, đậy giấy bạc, đun cách thủy ở 600C trong 15 phút. Ly tâm, lấy phần dịch trong phía trên lọc qua màng lọc đường kính lỗ 0,45 µm, dịch lọc thu được đem tiến hành sắc ký
2) Điều kiện sắc ký
Cột Inertsil C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm) với các thông số: detector UV 270 nm; tốc độ dòng 1ml/phút; pha động MeOH - H2O (35:65), thể tích tiêm 10 µl; nồng độ gentioptcrin trong dung dịch mẫu tiêm 0,2 mg/ml; thời gian phân tích 15 phút.
3.2 Thẩm định phương pháp định lượng.
Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng gentiopicrin trong điều kiện đã chọn được trình bày ở mục 3.1.3.
Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành chạy sắc ký 6 lần liên tiếp một mẫu gentiopicrin chuẩn được pha như chỉ dẫn pha dung dịch chuẩn trong mục 2.4.3 . Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5
Bảng 3.5: Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống
Lần 1 2 3 4 5 6 RSD (%) TR (phút) 8,161 8,151 8,171 8,163 8,136 8,135 0,182 Diện tích pic (mAU*s) 2539,79 2560,37 2560,18 2555,29 2566,61 2568,49 0,234
Nhận xét: RSD của thời gian lưu là 0,182 (<2%) và RSD diện tích pic là 0,234 (<2 %) là phù hợp yêu cầu đối với phương pháp định lượng hoạt chất gentiopicrin bằng HPLC
Tính chọn lọc - đặc hiệu
Tiến hành xử lý mẫu placebo và mẫu thử theo quy trình xử lý mẫu thử được trình bày ở mục “Quy trình xử lý mẫu” 3.1.3. Tiến hành sắc ký, so sánh hình dạng, vị trí pic trên sắc ký đồ. Ta thu được các hình dưới đây:
Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu gentiopicrin mẫu chuẩn
Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu gentiopicrin trong chế phẩm kem Viemda AD Nhận xét:
Trên sắc kí đồ của mẫu placebo, tại vị trí ứng với thời gian lưu của pic gentiopicrin không xuất hiện pic
Trên sắc ký đồ mẫu thử tại vị trí thời gian lưu của pic gentiopicrin chất chuẩn (tR = 8,161) xuất hiện một pic có tR = 8,130 phút, pic cân đối
Nhận xét: trong phạm vi nghiên cứu, phương pháp đáp ứng yêu cầu về tính chọn lọc để định lượng và định tính hoạt chất gentiopicrin.
Khoảng nồng độ tuyến tính
Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng bằng MeOH được các dung dịch có nông độ 0.10 - 0.30 mg/ml. Lọc. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn
(3.1.3) với 5 dung dịch chuẩn pha được thu được kết quả được trình bày ở Bảng 3.7 và Hình 3.8
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
Nồng độ 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
(mAU*S)
Hình 3.8: Đồ thị đường chuẩn gentiopicrin
Đường hồi quy tuyến tính có dạng đường thẳng với phương trình hồi quy y = 528384x +758298 , hệ số tương quan r2 = 0,9711. Như vậy, diện tích pic và nồng độ dung dịch phụ thuốc tuyến tính với nhau trong khoảng nồng độ khảo sát.
Độ chính xác
Độ tái lặp: tiến hành sắc ký đồng thời trên 6 lần song song trên cùng một mẫu thử thu được kết quả bảng sau:
Bảng 3.8: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp
STT Khối lượng mẫu
(g)
Diện tích pic (mAU*s) Hàm lượng (%)
gentiopicrin 1 0,5030 2437,63 0,3802 2 0,5012 2427,78 0,3800 3 0,5090 2538,20 0,3912 4 0,5011 2439,29 0,3819 5 0,5053 2548,35 0,3957 y = 528374x + 758298 R2 = 0.9711 0 500,000 1,000,000 1,500,000 2,000,000 2,500,000 3,000,000 3,500,000 4,000,000 0 1 2 3 4 5 6 Series1 Linear (Series1)
6 0,5040 2530,24 0,3939
Trung bình hàm lượng (%) gentiopicrin 0,3872
RSD (%) 1,87
Kết quả độ tái lặp của mẫu phân tích có RSD=1,87% (<2%). Phương pháp được xác định là đạt về độ chính xác trong ngàỵ
Độ lặp lại: tiến hành sắc ký trên 12 mẫu thử xử lý (3.1.3) trong 2 ngày khác nhaụ Ngày thứ nhất thu được bảng kết quả độ lặp lại trong ngàỵ Ngày thứ hai, thu được kết quả được trình bày ở Bảng 3.9
Bảng 3.9: Kết quả độ chính xác khác ngày của phương pháp
STT Khối lượng mẫu
(g) Diện tích pic (mAỤs) Hàm lượng (%) gentiopicrin 1 0,5100 2506,97 0,3856 2 0,5096 2534,34 0,3902 3 0,5042 2454,10 0,3818 4 0,5009 2385,67 0,3736 5 0,5038 2372,34 0,3694 6 0,5083 2400,94 0,3706
Trung bình hàm lượng gentiopicrin (%) 6 mẫu 0,3792
Trung bình hàm lượng gentiopicrin (%) 12 mẫu 0,3828
RSD (%) (12 mẫu) 2,23
Độ chính xác khác ngày của mẫu phân tích có RSD = 2,23% (<3%). Nhận xét: Phương pháp được tiến hành đạt về độ chính xác
Tiến hành xác định độ thu hồi của song song 3 mẫu tự tạo có hàm lượng gentiopicrin 80 %, 100 %, 120 % sau đó xử lý theo quy trình như đối với mẫu thử mục 3.1.3 thu được kết quả được trình bày trong Bảng 3.10
Bảng 3.10: Kết quả độ thu hồi của phương pháp Khối lượng placebo (g)