Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thẩm định phương pháp định lượng metformin trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với nội chuẩn là ranitidin. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO *; Nguyễ ă *; **; ũ uấn Anh** u ***; u ** TÓM TẮT o fortis phenyl (5 µm, - 2HPO4 - µg/m 97, - - 103,29% ự ể * DETERMINATION OF METFORMIN IN DOG PLASMA BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY SUMMARY Metformin is an oral biguanide medication, it has effective in reducing blood glucose levels in patients with type diabetes The aim of this study was to validate the analytical method of metformin in dog plasma by high pressure liquid chromatography (HPLC) with detector UV (at 232 nm) using ranitidin as an intenal standard After precipating protein in plasma by acetonitrile, metformin and internal standard were eluted from fortis phenyl column (5 m, 150 x 4.6 mm) at 25C with a mobile phase consisting of acetonitrile and 20 mM Na2HPO4 (60:40, v/v), at a flow rate of 1.0 ml/min The lower limit of quantitation was 0.05 µg/ml, with a relative standard deviation of less than 20% A linear range of 0.05 - µg/ml was established This HPLC method was validated with between - batch and within - batch precision of 2.70 - 6.35% and 3.59 - 6.76%, respectively The between - batch and within - batch accuracy was 97.43 - 100.96% and 94.62 103.29%, respectively This validated method is sensitive and repeatable enough to be used in bioavailability studies in dogs * Key words: Metformin; Plasma; HPLC * Trường Cao đẳng Dược Phú Thọ ** Học viện Quân y *** Trường Đại học Dược Hà Nội N N 13 p ả (C esp d y ậ b : 12/08/2014; N N ): N uyễ ă ( v@ a l.c yp ả b đá b bá : 16/09/2014 y b bá đ ợc đă : 25/09/2014 ) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ c ký l ng hi W ), detector UV, máy ly tâm l nh UNIVERSAL c), t l nh âm sâu DF8514 (Ilshinlab, Hàn Qu c) K ô ô P ô X ô q Ở q ô ng d n c gi i h t l thu h ặ [ ] [ ] ì ọ ặc hi u, n tính, [ ] K t q Q ự F A Vì ậ ì F A ì KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ọ q ự Kỳ ô huy ng metformin c xây dựng ể ữ ô é VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU N p ng vật thí nghi m, Học vi n Quân y cung c p W c c t (HPLC-Merck), dung mơi hố ch t khác t tiêu chu n PA chu n Vi n Kiểm nghi cung c ữ -250 14 L y 0,2 ml huy u tr ng/chu n/ thử) cho vào ng ly tâm Thêm 50 µl dung d ch ranitidin 7,5 µg/ml (n i chu n) 50 µl c c t; 0,4 ml dung d ch acetonitril, l , ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút L y d ch n i, lọc qua màng lọc 0,45 m D ch lọ c ể tiêm s c ký K q ự ọ c t fortis phenyl (5 m, 150 x 4,6 mm) Nhi c t: 25 ng: acetonitril m Na 2NPO (v/v) T dòng 1,0 ml/phút Detector UV c sóng 232 nm Thể tích tiêm m u: 50 l N i chu n ranitidin có n ng 7,5 g/ml TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 K ả nh * Độ đặc hiệu - chọn lọc: Phân tích m u huy n i chu n ranitidin (7,5 µg/ml) ng huy n (0,05 µg/ml) b a Hình 1: S m u huy s m u huy UV ể ng (a) a metformin ranitidin (b) ô ẳ ự q 3.107 Peak 322.7 0.014 3.092 Peak 233.8 227.9 a 0.012 0.12 AU AU 0.08 0.008 0.006 0.06 0.004 0.04 0.002 0.02 391.8 0.000 200.00 b 0.10 0.010 0.00 250.00 300.00 350.00 200.00 250.00 300.00 nm 350.00 nm Hình 2: Ph h p th c a pic có tR = 3,33 (ranitidin-a) tR = 4,26 (metformin-b) Bảng 1: K t qu kiể STT ặc hi u - chọn lọc c DiƯn tÝch pic mÉu tr¾ng (mAU*s) Rt từ 3,1 - 3,7 phút Tr ng/metformin Tr ng/ranitidin 328 - < 20% < 5% - - < 20% < 5% - 276 < 20% < 5% - - < 20% < 5% - 652 < 20% < 5% - - < 20% < 5% (“-“: không cú tớn hiu ỏp ng) 15 Tỷ lệ đáp ứng pic Rt từ 4,0 - 4,4 phút TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ểm trùng v i th T i th ô c ng pic c a m u tr ≤ n tích pic c a m u chu n (di n tích pic trung bình c a m u chu n metformin có n g n gi i h i 3.028 mAu.s) Trong kho ng th 3,1 - 3,7 phút, di n tích pic m u tr ≤ n tích pic n i chu n (di n tích pic ranitidin trung bình 68.279 mAu.s) ậ ậ metformin ảng : ự ọ ọ * Độ n tính: 1,0; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/ml q ì ự X q ữ metformin/ ranitidin ữ Tªn mÉu S1 S2 S3 S4 S5 S6 1,95 0,98 0,44 0,22 0,11 0,05 Di n tích pic metformin (mAU.s) 154.984 80.963 33.419 16.853 7.086 1.549 Di n tích pic ranitidin (mAU.s) 70.580 74.280 70.937 74.727 71.096 69.951 T l di n tích chu n/n i chu n 2,196 1,090 0,471 0,226 0,100 0,022 N thực (µg/ml) ì i quy (Y = aX + b)* N nh từ so v i giá tr thực (%) ng chu n Y = 1,1438X - 0,0303; R = 0,998 97,32 97,94 87,67 111,82 113,60 91,65 (*Y: tỷ lệ diện tích pic metformin/ranitidin; X: nồng độ metformin mẫu) q - ữ q é n ự - iv in th p nh t 85 - 115% cho l i) * i i hạn đ nh ượng dư i ( X Q: ng pic c a m u chu n, m u tr ng Tính n chu n từ t l di ng cách so sánh v i giá tr thực có m u 16 - metformin m u ng chu n; từ TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng : K q DiÖn tÝch pic (mAU.s) M u chu n (metformin 0,05 µg/ml) STT M u tr ng Metformin (Rt = 4,3 phút) Ranitidin (Rt = 3,3 phút) Rt từ 4,0 - 4,4 phút Rt từ 3,1 - 3,7 phút 2.483 68944 328 - 3.764 64835 - - 3.051 68432 - 276 3.742 68211 - - 3.471 68552 - 652 X 3.302 SD 541 RSD (%) 16,37 ặ ậ ọ * Độ độ ác ngày khác ngày: Ti ể 3m cn LQC (0,15 µg/ml), MQC (0,4 µg/ml) HQC (1,5 µ Q ậ ặ ữ ự ọ K q 100,96% (n m gi i h é é ọ 17 * Tỷ ệ thu hồi: X nh t l thu h i c a ch t chu n n i chu n b ng cách so sánh di n tích pic c a metformin ranitidin từ m u huy t i di n tích pic c a chúng m u ph ng có ch a n K q l 90,23% (n = 4), c a metformin n ng LQC, MQC HQC l t 70,94%, ặ D < 5% v i n i chu n, RSD < 10% v i chu n) * Độ n đ nh: n i chu n g q v i metformin ch chu n g c, ể nhi -200 -800 i i v i ranitidin TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng : nh th i gian ng n c a dung d ch chu n v n i chu n g c Kết định l-ợng Giai đoạn STT Chu n g c (mAU.s) N i chu n g c (mAU.s) Th ng kê B o qu n l nh o Sau gi /25 C Th ng kê 12.896 X = 12877 83.551 X = 86.893 13.525 SD = 904,8 87.965 SD = 2.265,6 11.591 87.526 13.495 88.530 12.759 X = 12635 85.609 X = 83.952 12.784 SD = 580,2 83.628 SD = 2.931,6 13.181 p = 0,668 86.606 p = 0,164 11.814 79.966 N trung bình c a dung d ch chu n g c n i chu n g ể b o qu n l ô ĩ > chu n g c dung d ch n i chu n g c b n vững u ki n nhi vòng gi m u ki qu n l nh từ - 20 ngày -80o nhi phòng ậy, dung d ch phòng nh n c ch t có ọn t i th ểm sau pha sau b o i v i metformin -20o i v i ranitidin Bng 5: Kết định l-ợng trung bình (n = 4) Giai đoạn Chu n g c (1.000 µg/ml) u Sau ngày Sau ngày Sau ngày Sau ngày Sau 20 ngày 18 N i chu n g c (1.500 µg/ml) X SD 1.000 32,06 X SD 1.500 59,75 X SD 973,80 15,23 X SD 1.575,76 58,01 p0 - 0,190 p0 - 0,119 X SD 974,29 4,16 X SD 1.491,99 11,85 p0 - 0,163 p0 - 0,801 X SD 952,66 29,18 X SD 1.465,02 11,37 p0 - 0,072 p0 - 0,294 X SD 1.033,91 21,02 X SD 1.449,47 32,80 p0 - 0,127 p0 - 0,189 X SD 970,19 38,33 X SD 1.479,82 20,43 p0 - 15 0,278 p0 - 15 0,546 nh c a m u huy ỳ ô - ô TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng 6: K q ỳ ô ô - Nång độ metformin (àg/ml) Giai đoạn M u LQC STT N Phân tích u) Sau chu kỳ ơ - M u HQC Th ng kê N Th ng kê 0,171 X = 0,165 0,170 X = 1,302 0,170 SD = 0,010 0,165 SD = 0,010 0,149 0,172 0,169 0,157 1,292 X = 0,166 1,285 X = 1,308 1,297 SD = 0,006 1,349 SD = 0,028 1,312 p = 0,831 1,299 p = 0,746 1,310 ỳ ô 1,296 ô - > q ì o sánh n LQC, HQC xử lý m q ì c lựa chọ tồn nhi phòng, m u LQC, HQC có n lý m ể tan ch y nhi phòng gi q Bảng 7: ì metformin m u ể tan ch y hồn ti n hành xử Nång ®é metformin (àg/ml) Giai đoạn M u LQC STT N M M u HQC Th ng kê Th ng kê 0,171 X = 0,165 1,292 X = 1,302 0,170 SD = 0,010 1,297 SD = 0,010 0,149 1,312 0,169 1,310 0,165 X = 0,167 1,303 X = 1,320 0,169 SD = 0,002 1,310 SD = 0,016 0,169 p = 0,697 1,331 p = 0,111 0,164 c xử lý M gi c xử lý sau ể tan ch y nhi t phòng N sau gi - metformin m ể tan ch y nhi Q 1,335 Q c xử lý so v i m c xử lý ô ĩ ng kê (p > 0,05) nh c a m u huy Q X nh n metformin có m u t i th sau 7, 17 27 ngày b o qu n m u -20oC 19 N u LQC ểm sau pha TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng 8: K q Nồng độ metformin (àg/ml) Giai đoạn STT M u LQC M M u HQC 0,157 X = 0,151 1,373 X = 1,434 0,149 SD = 0,005 1,553 SD = 0,101 0,153 1,480 0,146 1,332 0,156 X = 0,159 1,366 X = 1,380 0,148 SD = 0,010 1,349 SD = 0,038 0,158 p = 0,221 1,371 p = 0,353 0,172 0,150 X = 0,154 1,510 X = 1,511 0,152 SD = 0,004 1,421 SD = 0,065 0,156 p = 0,377 1,571 p = 0,251 0,158 0,155 X = 0,161 1,333 X = 1,317 0,164 SD = 0,007 1,289 SD = 0,025 0,171 p = 0,060 1,343 p = 0,064 0,156 u Sau ngày 1,435 Sau 17 ngày 1,540 Sau 27 ngày 1,304 N metformin m u b o qu n u ki n -20oC vòng 7, 17 27 ngày so v i n metformin m u m i pha khác bi ô ĩ th > ậy, metformin nh huy u ki n b o qu n -20oC KẾT LUẬN Q pháp th ng metformin huy t ự ọ q ì ể y 0,2 ml huy (m u tr ng/chu n/thử) cho vào ng ly tâm Thêm 50 µl dung d ch ranitidin 7,5 µg/ml (n i chu n) 50 µl c c t, 0,4 ml acetonitril, l c xoáy 30 giây 0,45 m D ch lọ tiêm s c ký phenyl (5 C Na2HPO4 0,02 M, ể UV ể g/ml Q ì ọ y d ch n i lọc qua màng lọc 20 ự q TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 F A Center for drug evaluation and research Guidance for industry, bioanalytical method validation FDA, US, Department of Health and Human Service 2001 ọ ậ ể q ì ể é TÀI LIỆU THAM KHẢO Dược thư quốc gia Việt Nam Y Thông tư hư ng dẫn báo cáo số iệu nghiên cứu sinh khả dụng/tương đương sinh học đăng ký thuốc Y 2010 21 Himal Paudel Chhetri Simple HPLCUV method for the quantification of metformin in human plasma with one step protein precipitation Saudi Pharmaceutical Journal 2014, pp.1-5 Valentina Porta HPLC-UV determintaion of metformin in human plasma for application in pharmacokinitics and bioequivalence studies 2007, pp.143-147 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 22 ... ngày 1,304 N metformin m u b o qu n u ki n -20oC vòng 7, 17 27 ngày so v i n metformin m u m i pha khác bi ô ĩ th > ậy, metformin nh huy u ki n b o qu n -20oC KẾT LUẬN Q pháp th ng metformin huy... giá tr thực có m u 16 - metformin m u ng chu n; từ TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ảng : K q DiÖn tÝch pic (mAU.s) M u chu n (metformin 0,05 µg/ml) STT M u tr ng Metformin (Rt = 4,3 phút)... m u chu n metformin có n g n gi i h i 3.028 mAu.s) Trong kho ng th 3,1 - 3,7 phút, di n tích pic m u tr ≤ n tích pic n i chu n (di n tích pic ranitidin trung bình 68.279 mAu.s) ậ ậ metformin