Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng doxorubicin (DOX) trong huyết tương chuột, ứng dụng trong đánh giá sinh khả dụng, tương đương sinh học của các chế phẩm chứa DOX trên thực nghiệm.
Tạp chí y - dợc học quân số 6-2017 ĐỊNH LƯỢNG DOXORUBICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG CHUỘT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Bùi Bá Minh* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng doxorubicin (DOX) huyết tương chuột, ứng dụng đánh giá sinh khả dụng, tương đương sinh học chế phẩm chứa DOX thực nghiệm Phương pháp: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng DOX huyết tương chuột sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) theo hướng dẫn FDA Kết quả: xây dựng quy trình định lượng DOX HPLC với điều kiện sau: xử lý mẫu tủa protein với acetonitril; cột Gemini C18; µm, 250 x mm; pha động: acetonitril - amoni nitrat 0,25 g/l nước với tỷ lệ 30:70 (v/v); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector: PDA 232 nm; thể tích tiêm mẫu: 10 µl; thời gian chạy: 10 phút; nội chuẩn daunorubicin µg/l Phương pháp có độ đặc hiệu, chọn lọc tốt, thời gian lưu DOX trung bình 3,5 phút, tách biệt daunorubicin với thời gian lưu trung bình 5,7 phút Mẫu trắng có đáp ứng nhỏ 5% so với mẫu chuẩn nội chuẩn Độ lặp lại tốt với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ngày từ 2,1 - 3,8 % khác ngày từ 3,62 - 4,68% Độ đạt 91,7 - 98,4% với khoảng nồng độ từ - 100 µg/l Độ tuyến tính từ - 100 µg/l với R 0,9995 Giới hạn định lượng µg/l Phương pháp xử lý mẫu có hiệu suất chiết cao (94,2 - 98,8%) với RSD < 4% Mẫu huyết tương ổn định sau chu kỳ đông - rã trình xử lý mẫu Kết luận: quy trình áp dụng để định lượng DOX huyết tương chuột * Từ khóa: Doxorubicin; Huyết tương chuột; Sắc ký lỏng hiệu cao Determination of DOX Concentration in Mouse Plasma by High Performance Liquid Chromatography Summary Objectives: To develop and validate the method of DOX determination in mouse plasma to assess the bioavailability, the biological equivalence of the DOX-containing compositions Methods: Development and validation a method of quantifying DOX in mouse plasma by HPLC according to FDA guidelines Results: Analytical procedures: the sample is processed by precipitating the protein with acetonitrile Column gemini C18, µm, 250 x mm; mobile phase: acetonitrile - ammonium nitrate 0.25 g/L in water at a ratio of 30:70 (v/v); flow rate: 1.0 mL/min; detector: PDA at 232 nm; injection volume: 10 µL; runtime: 10 minutes; internal standard is daunorubicin µg/L The method has a good selectivity, response of blank samples were 5% less than standard and internal standard samples The precision was good with RSD intra-day and inter-day during the day ranged from 2.1 to 3.8% and day to day ranged from 3.62 to 4.68% * Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Bùi Bá Minh (minh_phar@yahoo.com) Ngày nhận bài: 11/04/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 07/08/2017 Ngày báo đăng: 10/087/2017 154 T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2017 The accuracy was 91.7 - 98.4% with concentrations ranging from - 100 µg/L The method has a linearity of - 100 µg/L with R of 0.998 LLOQ was µg/L The high extraction efficiency (94.2 - 98.8%) with RSD < 4% was obtained Plasma samples were stable after cycles of freezing and during sample processing Conclusions: Analytical procedures should be applied to quantify DOX in mouse plasma * Keywords: Doxorubicin; Mouse plasma; High performance liquid chromatography ĐẶT VẤN ĐỀ Y học đại trọng đến hiệu điều trị thuốc bệnh nhân Để làm điều này, việc định lượng nồng độ thuốc máu, dịch sinh học cần thiết DOX thuốc chống ung thư dùng phổ biến Phương pháp định lượng DOX chế phẩm có Dược điển Mỹ, chưa có phương pháp định lượng DOX dịch sinh học [4] Khó khăn việc định lượng dịch sinh học nồng độ thuốc thấp ảnh hưởng môi trường Nghiên cứu nhằm: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng nồng độ DOX huyết tương chuột theo hướng dẫn FDA, ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng, tương đương sinh học chế phẩm chứa DOX thực nghiệm ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Huyết tương chuột có chứa DOX * Thiết bị vật liệu: - Huyết tương chuột Ban Cung cấp Động vật Thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp - Chất chuẩn DOX hydrochlorid USP RS, lô L0K258, hàm lượng 99,8% daunorubicin hydrochlorid USP RS, lô M1M099, hàm lượng 99,5% Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW cung cấp Phương pháp nghiên cứu * Xây dựng phương pháp phân tích: - Xây dựng quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm: khảo sát phương pháp xử lý mẫu, chiết tách DOX để định lượng - Xác định điều kiện sắc ký: dựa vào tài liệu tham khảo điều kiện thực tế, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký: cột sắc ký, thành phần pha động, chất nội chuẩn, thể tích tiêm mẫu, thời gian tiêm mẫu để định lượng DOX dịch sinh học * Thẩm định phương pháp: Thẩm định phương pháp định lượng chất dịch sinh học theo hướng dẫn FDA [3] - Chuẩn bị: - Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, autosampler, detector PDA Các máy ly tâm lạnh, ly tâm thường + Dung dịch chuẩn làm việc DOX (400 µg/ml, 200 µg/ml, 80 µg/ml, 40 µg/ml, 20 µg/ml, µg/ml, µg/ml) pha nước - Dung mơi hóa chất đạt chuẩn phân tích chuẩn cho HPLC + Dung dịch nội chuẩn daunorubicin (DAU) có nng 40 àg/ml pha nc 155 Tạp chí y - dợc học quân số 6-2017 + Mu trắng: huyết tương trắng không chứa chuẩn nội chuẩn + Mẫu nội chuẩn: huyết tương trắng không chứa chuẩn, chứa nội chuẩn + Mẫu chuẩn: pha loãng dung dịch chuẩn nội chuẩn làm việc với huyết tương trắng để thu mẫu chuẩn nồng độ thích hợp + Mẫu QC (Quality Control): mẫu QC chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc độc lập với dung dịch chuẩn gốc dùng để pha mẫu chuẩn * Khảo sát tiêu thẩm định theo hướng dẫn FDA: - Tính đặc hiệu, chọn lọc: Tiến hành sắc ký mẫu trắng; mẫu nội chuẩn; mẫu chuẩn mẫu thử Đáp ứng mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu DOX, không vượt 20% đáp ứng mẫu chuẩn Đáp ứng mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu nội chuẩn phải không vượt 5% đáp ứng nội chuẩn - Độ lặp lại ngày, độ lặp lại khác ngày: + Độ lặp lại ngày: đo QC mức nồng độ, mức nồng độ mẫu độc lập ngày Giá trị RSD phải ≤ 15% + Độ lặp lại ngày: tiến hành tương tự xác định độ lặp lại ngày, ngày Giá trị RSD phải ≤ 15% - Độ đúng: Tiến hành định lượng lô mẫu QC khoảng nồng độ thấp (LQC), trung bình (MQC) cao (HQC), lơ mẫu gồm mẫu độc lập So sánh giá trị trung bình lần định lượng với giá trị lý 156 thuyết có mẫu Độ phương pháp nồng độ phải nằm khoảng 85 - 115% - Hiệu suất chiết: So sánh kết định lượng mẫu LQC; MQC HQC với mẫu chuẩn pha pha động (không qua chiết tách), có nồng độ tương ứng Hiệu suất chiết phải không 110% không thấp 30%; RSD giá trị hiệu suất chiết nồng độ khơng q 15% hiệu suất chiết trung bình nồng độ khác không ± 15% - Khoảng tuyến tính: Phân tích mẫu chuẩn DOX huyết tương có nồng độ từ 1/40 đến - lần nồng độ tối đa dự tính Hệ số tương quan tỷ lệ đáp ứng píc DOX/DAU nồng độ DOX phải lớn 0,98 75% số điểm đường chuẩn, bao gồm mẫu có nồng độ thấp mẫu có nồng độ cao phải có độ nằm khoảng từ 85 - 115%, riêng điểm thấp đường chuẩn cho phép sai số không 20% - Giới hạn định lượng (LLOQ): Tiến hành sắc ký mẫu trắng mẫu chuẩn có nồng độ 1/10 - 1/30 Cmax Nồng độ coi giới hạn định lượng sắc ký đồ mẫu chuẩn nồng độ cho píc DOX tách biệt với píc tạp, có độ từ 80 - 120%; độ lặp lại với giá trị RSD ≤ 20% đáp ứng píc DOX ≥ lần đáp ứng mẫu trắng - Độ ổn định DOX huyết tương: Xác định độ ổn định DOX sau chu kỳ đơng - rã đơng; q trình xử lý mẫu mẫu LQC HQC T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2017 + ổn định sau chu kỳ đông - rã: o Bảo quản mẫu nhiệt độ -20 C 24 giờ, lấy mẫu để tan nhiệt độ phòng Sau tan chảy hồn tồn, để mẫu trở lại đông lạnh 12 - 24 Lặp lại chu kỳ đông - rã đông lần Tiến hành phân tích mẫu sau lần để rã đơng thứ Kết lượng DOX có mẫu sau chu kỳ đông - rã đông mẫu phân tích trước để đơng phải sai khác khơng có ý nghĩa thống kê + Độ ổn định trình xử lý mẫu: So sánh nồng độ DOX có mẫu chiết tách sau rã đông mẫu có nồng độ tương ứng chiết tách sau rã đông để nhiệt độ phòng tối thiểu Kết phải sai khác khơng có ý nghĩa thống kê KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng phương pháp phân tích * Quy trình xử lý mẫu: - Chuẩn bị mẫu: lấy 0,2 ml huyết tương cho vào ống ly tâm Thêm 50 µl dung dịch chuẩn (hoặc QC), lắc xốy 30 giây Thêm 50 µl dung dịch DAU 40 µg/ml (nội chuẩn), lắc xốy 30 giây - Chiết tách DOX: thêm vào mẫu phân tích 0,2 ml dung dịch acetonitril, lắc xoáy phút Ly tâm 10.000 vòng/phút x 10 phút Lấy dịch nổi, lọc qua màng 0,45 µm Dịch lọc thu dùng để tiêm sắc ký * Kết lựa chọn điều kiện sắc ký: Qua tham khảo tài liệu [1, 2, 4] khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký gồm: - Cột: Gemini C18; µm, 250 x mm Nhiệt độ cột: 25°C - Pha động: acetonitril - amoni nitrat 0,25 g/l nước với tỷ lệ 30:70 (v/v) +Tốc độ dòng 1,0 ml/phút + Detector: PDA 232 nm + Thể tích tiêm mẫu: 10 µl + Thời gian chạy: 10 phút + Nội chuẩn DAU nồng độ huyết tương µg/ml Với điều kiện sắc ký này, tách phân biệt píc DOX píc DAU với hệ số tách 1,64 Diện tích píc DOX trung bình 12.682 mAU.s diện tích píc DAU trung bình 133.176 mAU.s mẫu chứa µg/ml chuẩn DOX µg/ml nội chuẩn DAU Các đáp ứng píc lớn lần so với mẫu huyết tương trắng (hình 1) Thẩm định phương pháp phân tích * Độ đặc hiệu - chọn lọc: Tiêm lặp lại lần mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa DOX µg/ml DAU µg/ml sau xử lý mẫu theo quy trình lựa chọn Kết phân tích cho thấy DOX có thời gian lưu (tR) trung bình 3,46 phút, RSD 0,68%; DAU có thời gian lưu trung bình 5,66 phút, RSD 0,19% Mẫu trắng có đáp ứng nhỏ 5% so với mẫu chuẩn Píc DOX có hệ số đối xứng (SF) 1,04; số đĩa lý thuyt (N) 9.860 157 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 6-2017 0.030 a 0.025 0.020 AU 0.015 0.010 0.005 0.000 -0.005 -0.010 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Minutes 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.030 b 0.020 DAU 5.692 0.025 AU 0.015 0.010 0.005 0.000 -0.005 -0.010 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Minutes 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.030 AU 5.980 DAU DOC 3.246 0.020 c 0.010 0.000 -0.010 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Minutes 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Hình 1: Sắc ký đồ huyết tương trắng (a), huyết tương có chứa nội chuẩn DAU (b), huyết tương có chứa chuẩn DOX nội chuẩn DAU (c) 158 Tạp chí y - dợc học quân số 6-2017 * Độ lặp lại, độ đúng: - Độ lặp lại, độ ngày: Phân tích mẫu LQC (3 µg/ml), MQC (20 µg/ml) HQC (80 µg/ml), mẫu lần ngày Bảng 1: Kết độ lặp lại, độ ngày Mẫu n Độ trung bình SD RSD LQC 91,71% 1,94 2,11% MQC 98,37% 3,01 3,06% HQC 93,79% 3,55 3,78% Phương pháp có độ tốt (91,71 - 98,37%); độ lặp lại ngày với giá trị RSD nhỏ (2,1 - 3,8%), đáp ứng yêu cầu độ lặp lại, độ phương pháp phân tích dịch sinh học - Độ lặp lại, độ khác ngày: Phân tích mẫu LQC (3 µg/ml), MQC (20 µg/ml) HQC (80 µg/ml), mẫu lần ngày, ngày Bảng 2: Kết độ lặp lại, độ khác ngày Mẫu n Độ trung bình SD RSD LQC 15 90,24% 3,35 3,71% MQC 15 99,70% 3,61 3,62% HQC 15 93,76% 4,39 4,68% Ở nồng độ (3; 20 80 µg/ml), phương pháp cho độ 90,2 - 99,7% độ lặp lại khác ngày với giá trị RSD < 10% (3,62 - 4,68%) chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có độ lặp lại, độ cao, đáp ứng yêu cầu phương pháp dùng sinh học * Khoảng tuyến tính: Phân tích mẫu chuẩn DOX huyết tương có nồng độ 1; 2; 5; 10; 20, 50; 100 µg/ml, chuẩn bị theo quy trình xây dựng Xác định mối tương quan nồng độ DOX huyết tương tỷ lệ diện tích píc DOX/DAU đo Kết trình bày bảng hình 159 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2017 Bng 3: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Tên mẫu S1 Nồng độ (µg/ml) S2 S3 S4 S5 S6 S7 1,0 2,0 5,0 10,0 20,0 50,0 100,0 Diện tích píc DOX (mAU.s) 12682 27741 63892 134767 278820 745751 1482674 Diện tích píc DAU (mAU.s) 133176 140509 143982 142302 139784 138313 142503 0,947 1,995 5,392 10,405 Tỷ lệ diện tích chuẩn/nội chuẩn 0,095 0,197 0,444 Tỷ lệ diện tích chuẩn/ nội chuẩn Nồng độ (µg/l) Hình 2: Đồ thị tương quan nồng độ DOX tỷ lệ diện tích píc DOX/DAU Phương pháp có khoảng tuyến tính từ 1,0 - 100,0 µg/l với hệ số tương quan R 0,9995 * Giới hạn định lượng dưới: Phân tích mẫu trắng mẫu chuẩn có nồng độ thấp khoảng tuyến tính (1 µg/ml) Xác định đáp ứng píc mẫu chuẩn, mẫu trắng Tính nồng độ DOX mẫu chuẩn từ tỷ lệ diện tích DOX/DAU đường chuẩn Bảng 4: Kết xác định giới hạn định lượng Diện tích píc (mAU.s) Stt Mẫu chuẩn (1 µg/ml) Mẫu trắng DOX (Rt = 3,5 phút) DAU (Rt = 5,7 phút) 3,3 - 3,9 phút 5,4 - 5,8 phút 9.682 123.845 474 455 13.108 133.276 - 307 13.256 145.198 - 586 12.378 140.255 505 995 10.454 138.766 773 734 Trung bình 11.776 SD 1.617 RSD (%) 13,73 160 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 6-2017 Tại vị trí có thời gian lưu khoảng 3,5 phút đáp ứng mẫu chuẩn có nồng độ µg/ml gấp 20 lần đáp ứng mẫu trắng độ lặp lại sau lần phân tích với RSD < 20% Như vậy, mẫu chuẩn chứa DOX có nồng độ µg/ml đáp ứng u cầu giới hạn định lượng phương pháp phân tích dịch sinh học * Hiệu suất chiết phương pháp: Tiến hành định lượng mẫu LQC; MQC HQC với mẫu chuẩn pha pha động (không qua chiết tách) với nồng độ tương ứng Bảng 5: Hiệu suất chiết khoảng nồng độ Mẫu n Hiệu suất chiết SD RSD LQC 94,20% 3,44 3,65% MQC 98,80% 3,92 3,97% HQC 97,57% 3,22 3,30% Ở khoảng nồng độ 3; 20 80 µg/ml, phương pháp cho hiệu suất chiết cao (từ 94,2 - 98,8%); độ lặp lại tốt (RSD < 4%) hiệu suất chiết trung bình nồng độ chênh lệch khơng q 5% Do đó, phương pháp xử lý mẫu xây dựng phù hợp để chiết tách DOX từ huyết tương chuột * Độ ổn định DOX huyết tương: - Độ ổn định sau chu kỳ đông - rã đông: định lượng DOX trước sau chu kỳ đông - rã đông mẫu LQC HQC Bảng 6: Độ ổn định sau chu kỳ đông - rã đông Mẫu Trước để đông n Sau chu kỳ đông - rã đơng Trung bình SD Trung bình SD p LQC 2,82 0,11 2,63 0,12 > 0,05 MQC 19,14 0,59 18,16 0,64 > 0,05 HQC 79,86 3,13 75,54 3,18 > 0,05 Sau chu kỳ đông - rã đông, định lượng DOX mức nồng độ LQC, MQC HQC khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với trước để đông - Độ ổn định trình xử lý mẫu: định lượng DOX có mẫu LQC, MQC, HQC tách chiết sau rã đơng mẫu có nồng độ tương ứng chiết tách sau rã đơng, để nhiệt độ phòng 161 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2017 Bng 7: Độ ổn định trình xử lý mẫu Mẫu n Ngay sau rã đông Sau rã đông Trung bình SD Trung bình SD p LQC 2,78 0,11 2,69 0,12 > 0,05 MQC 18,84 0,58 18,28 0,62 > 0,05 HQC 79,61 3,11 75,83 3,17 > 0,05 Hàm lượng DOX mức nồng độ LQC, MQC HQC ổn định trình xử lý mẫu Như vậy, nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng DOX huyết tương chuột Kết thẩm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu theo hướng dẫn FDA KẾT LUẬN Đã xây dựng phương pháp định lượng DOX huyết tương chuột HPLC Phương pháp thẩm định với thông số theo hướng dẫn FDA đạt yêu cầu Phương pháp có độ đặc hiệu với mức đáp ứng mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu mẫu chuẩn không 5% Độ lặp lại ngày khác ngày với độ lệch chuẩn tương đối < 5% Phương pháp có độ 90,2 - 99,7% mức nồng độ thấp, trung bình cao Khoảng tuyến tính phương pháp từ - 100 µg/l Giới hạn định lượng µg/l Phương pháp xử lý mẫu cho hiệu suất chiết cao từ 94,2 - 98,8% Mẫu huyết tương ổn định sau chu kỳ đông - rã đơng q trình xử lý mẫu Với kết này, ứng dụng đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học 162 chế phẩm chứa DOX thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Deng W.J, Zeng Z.L, Liang Y.J, Dai C.L, Zhang J.Y, Fu L.W Detecting DOX concentration in KBv200 and KB cell xenografts in nude mice by high-performance liquid chromatography Ai Zheng 2008, Apr, 27 (4), pp.364-368 Kimberley M Laginha, Sylvia Verwoert, Gregory J.R Charrois and Theresa M Allen Determination of DOX levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors Clin Cancer Res 2005, October 1, 11, 6944 U.S Department of Health and Human Services Food and drug administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation 2001 USP 38-NF33 DOX hydrochloride for injection 2015 ... pháp xử lý mẫu, chiết tách DOX để định lượng - Xác định điều kiện sắc ký: dựa vào tài liệu tham khảo điều kiện thực tế, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký: cột sắc ký, thành phần pha động, chất... đáp ứng píc lớn lần so với mẫu huyết tương trắng (hình 1) Thẩm định phương pháp phân tích * Độ đặc hiệu - chọn lọc: Tiêm lặp lại lần mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa DOX µg/ml DAU µg/ml... 3.00 4.00 5.00 Minutes 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Hình 1: Sắc ký đồ huyết tương trắng (a), huyết tương có chứa nội chuẩn DAU (b), huyết tương có chứa chuẩn DOX nội chun DAU (c) 158 Tạp chí y -